Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники

ГЕНЕРАТОР ИМПУЛЬСОВ С РЕГУЛИРОВКОЙ ЧАСТОТЫ

   Как-то попросили меня сделать простую мигалку, чтоб реле управлять или маломощной лампочкой мигать. Собирать простейший мультивибратор, будь то симметричный или не симметричный, как-то банально, да и схема нестабильна и не совсем надежна, при том что работать она должна при напряжение 24 вольта в грузовом автомобиле, да и еще размеры иметь не слишком большие.

Схема

   Поискав по сети схемы, решил по даташиту включить популярную микросхему NE555N. Прецизионный таймер, стоимость которого очень мала – порядка 10 рубликов за микросхему в дип корпусе! Но так как нагрузка у нас не совсем слабая, и может потребоваться большие токи относительно питания таймера, то нам нужен какой-то ключ, которым и будет управлять сам таймер.

   Можно взять обычный транзистор, но он будет греться ввиду больших потерь из-за больших падений на переходах – поэтому взял высоковольтный полевой транзистор на несколько ампер тока, такому ключу при токе даже в 2 ампера не потребуется радиатор вообще.

   Сам таймер 555 имеет ограничения в питающем напряжение – порядка 18 вольт, хотя уже и при 15 может смело вылететь, поэтому собираем цепочку из ограничительного резистора и стабилитрона с фильтрующим конденсатором по входу питания!

   В схему введен регулятор, дабы можно было вращая ручку регулятора изменить частоту импульсов вспышки лампочки или срабатывания реле. Если же регулировка не требуется, можно подстроить частоту на нужные, замерить сопротивление и впаять потом готовое. На приведённой выше — сразу 2 регулятора, которыми меняется скважность (отношение включенного состояния выхода к выключенному). Если требуется соотношение 1:1 — убираем всё кроме одного переменного резистора.

Видео

   Часть элементов выполнено в дип корпусах, часть в смд — для компактности и лучшей компоновки в целом.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Схема генератора импульсов заработала после включения практически сразу, осталось только подстроить под нужную частоту. Плату желательно залить термоклеем или поставить в корпус из пластика, дабы автовладельцы не догадались ее прикрутить напрямую к корпусу или положить на что-то металлическое.

Генератор импульсов с независимым регулированием частоты и скважности

Не так давно мне потребовалось собрать генератор прямоугольных импульсов со сравнительно мощным выходом и плавным ручным регулированием частоты и скважности. Имея некоторый опыт, я сразу решил, что основой генератора должна стать микросхема-таймер NE555 (КР1006ВИ1). Её выпускают не один десяток лет, она дёшева, надежна, имеет отличные характеристики и легко согласуется с логическими микросхемами структуры КМОП и ТТЛ. Напряжение питания таймера может лежать в пределах от 5 до 15 В, а выход выдерживает ток нагрузки до 200 мА.

К сожалению, поиск в Интернете подходящей схемы генератора не дал результата. Все найденные страдали одним и тем же недостатком — при изменении частоты менялась и скважность выходных импульсов. Или же регулировка скважности плавная, а частота — ступенчатая, с помощью переключателя. В результате нужный генератор был разработан самостоятельно.

Как известно, в таймере NE555 имеются два компаратора напряжения. Порог срабатывания одного из них (условно верхнего) без подключения дополнительных резисторов равен 2/3 напряжения питания, а второго (нижнего) — в два раза меньше. Напряжение на времязадающем конденсаторе при работе генератора колеблется между этими порогами. Для изменения скважности известен классический приём — подать напряжение с выхода микросхемы через разнонаправленные диоды на крайние выводы переменного резистора, регулирующего скважность, а его движок соединить с времязадающим конденсатором. При такой регулировке частота импульсов не изменяется, так как сумма сопротивлений резисторов, через которые заряжается и разряжается конденсатор, остаётся постоянной.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники

Но как плавно регулировать частоту, не изменяя скважность? Я решил делать это, управляя разностью порогов срабатывания компараторов. Чем она меньше, тем меньше при прочих равных условиях уходит времени на перезарядку конденсатора от одного порога до другого и обратно, тем выше становится частота импульсов.

В микросхеме NE555 верхнее пороговое напряжение выведено на вывод 5, а для нижнего внешний вывод, к сожалению, не предусмотрен. Если подключить между выводом 5 и общим проводом переменный резистор, он будет одновременно регулировать оба порособрать генератор прямоугольных импульсов со сравнительно мощным выходом и плавным ручным регулированием частоты и скважности. Имея некоторый опыт, я сразу решил, что основой генератора должна стать микросхема-таймер NE555 (КР1006ВИ1). Её выпускают не один десяток лет, она дё-

га. Однако нижний останется равным половине верхнего, «отдаляясь» от плюса напряжения питания генератора медленнее, чем верхний порог «приближается» к его минусу. Это сказывается на относительной скорости нарастания и спада напряжения на конденсаторе и приводит к изменению скважности импульсов при регулировке частоты.

Рис. 1

Проблему удаётся решить, собрав генератор по схеме, изображённой на рисунке. Здесь внутренний нижний компаратор таймера DA2 заменён внешним, собранным на отдельной микросхеме DA1. Его неинвертирую-щий вход соединён с времязадающим конденсатором С1, а к инвертирующему входу подключён делитель напряжения из резисторов R2, R3, R6-R8, задающий порог срабатывания. При разомкнутой цепи переменного резистора R7 или при его очень большом сопротивлении порог срабатывания компаратора DA1 точно такой же, как у отключённого внутреннего компаратора таймера DA2 — 1/3 напряжения питания. Этого равенства добиваются подстроенным резистором R3. Уменьшая сопротивление переменного резистора R7, симметрично относительно половины напряжения питания сближают пороги верхнего компаратора таймера DA2 и внешнего компаратора DA1.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники В результате частота импульсов растёт, а их скважность, установленная переменным резистором R4, остаётся неизменной.

Нужно сказать, что в первом варианте генератора, схему которого я опубликовал на форуме интернет-портала KAZUS.RU http://kazus.ru/forums/ showthread.php?t=94852, резистор R6 отсутствует. Но, как выяснилось, без него не удаётся добиться полной симметрии порогов, мешает имеющийся внутри таймера соединённый с его выводом 5 делитель напряжения, формирующий из верхнего порога нижний. Резистор R6, сопротивление которого равно сумме сопротивлений резисторов этого делителя, компенсирует его влияние, делая симметричной полную схему формирования порогов.

Субъективно качество балансировки можно оценить, подключив между выводом 3 таймера и общим проводом вольтметр постоянного напряжения. Его показания должны зависеть только от положения переменного резистора R4. При регулировке частоты переменным резистором R7 они изменяться не должны. Этого добиваются с помощью подстроенного резистора R3. Если частота импульсов настолько низка, что стрелка вольтметра колеблется им в такт, следует подключить вольтметр к таймеру через интегрирующую RC-цепь с достаточно большой постоянной времени или временно повысить частоту импульсов, установив конденсатор С1 меньшей ёмкости.

При указанных на схеме номиналах элементов и напряжении питания 15 В переменный резистор R7 регулирует частоту импульсов приблизительно от 50 до 830 Гц. Однако снижение напряжения питания до 5 В ведёт к уменьшению частоты почти в два раза. В связи с этим желательно питать генератор стабилизированным напряжением.

Нагрузочная способность выхода таймера NE555 позволяет напрямую управлять довольно мощными исполнительными устройствами и ключевыми элементами. Это обстоятельство, а также возможность независимого регулирования частоты и скважности может обусловить широкий спектр применения генератора.

Автор: П. Галашевский, г. Херсон, Украина

Генератор импульсов АКИП-3301 — цена, отзывы, характеристики, фото

Генератор импульсов АКИП-3301 применяется для генерации импульсов прямоугольной формы.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Прибор используется для экспериментальных исследований и образовательных приложений, в лабораторном тестировании, электронном моделировании, техническом дизайне, отладке и ремонте РЭА. Принцип действия основан на технологии прямого цифрового синтеза. Частота формируемых импульсов напряжения на выходе генератора синхронизирована с частотой внутреннего или внешнего опорного генератора. Прибор выполнен в виде компактного моноблока, на передней панели которого расположены органы управления и дисплей.

  • Напряжение питания, В 220
  • Поверка нет
  • Внесен в госреестр да
  • Вес, кг 3
  • Габариты, мм 254х103х384

Наша компания не проводит поверку измерительного инструмента. Но вы можете обратиться в специальную метрологическую службу, у которой есть лицензия на эту услугу.

Комплектация *

  • Генератор АКИП-3301 — 1 шт.
  • Шнур питания — 1 шт.
  • Соединительный кабель — 2 шт.

Параметры упакованного товара

Единица товара: Штука
Вес, кг: 8,00

Длина, мм: 200
Ширина, мм: 200
Высота, мм: 300

Преимущества

  • Высокая точность установки временных параметров 5×10-5
  • Режим одиночных и парных импульсов, регулируемая задержка между основным и синхроимпульсом
  • Для двух каналов – независимая регулировка параметров
  • Диапазон частот от 0,1 мГц до 50 МГц
  • Выход до 5 В на нагрузке 50 Ом
  • Регулировка смещения (± 5 В)
  • Вход внешней опорной частоты
  • Индикатор VFD 40 символов

Произведено

  • Россия — родина бренда
  • Китай — страна производства*
  • Информация о производителе

* Производитель оставляет за собой право без уведомления дилера менять характеристики, внешний вид, комплектацию товара и место его производства.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники

Указанная информация не является публичной офертой

На данный момент для этого товара нет расходных материалов

Сервис от ВсеИнструменты.ру

Мы предлагаем уникальный сервис по обмену, возврату и ремонту товара!

Обратиться по обмену, возврату или сдать инструмент в ремонт вы можете в любом магазине или ПВЗ ВсеИнструменты.ру.

Гарантия производителя

Гарантия производителя 1 год

Генератор импульсов с независимой регулировкой фазы

Что-то не так?

Пожалуйста, отключите Adblock.

Портал QRZ.RU существует только за счет рекламы, поэтому мы были бы Вам благодарны если Вы внесете сайт в список исключений.
Мы стараемся размещать только релевантную рекламу, которая будет интересна не только рекламодателям, но и нашим читателям. Отключив Adblock, вы поможете не только нам, но и себе. Спасибо.

Как добавить наш сайт в исключения AdBlock

Roberta Tovar Medina.

Институт прикладной математики (Университет Мехико, Мексика)

В схеме фазовой автоподстройки часто необходимо иметь
генератор сигнала, фаза которого могла бы регулироваться независимо от других
параметров. Предлагается схема, состоящая из таймера типа 555 и нескольких
дискретных компонентов и представляющая собой генератор импульсов с независимой
и плавной регулировкой фазы в пределах от 0 до 180°.




рис. 1

Таймер U1 (рис. 1) с транзистором Q1 и конденсатором C1
генерирует пилообразный сигнал, крайними значениями которого являются напряжения
Vcc/3 и 2Vcc/3 (рис.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники 2). Каждому периоду пилообразного сигнала соответствует
короткий импульс на выходе U1. Этот импульс переключает триггер Uз-a,
генерирующий опорный сигнал QA. Сигнал с выхода компаратора, сравнивающего
пилообразный сигнал с опорным напряжением на движке переменного резистора R4,
переключает триггер Нз-b, генерирующий импульсы QB, сдвинутые по фазе
относительно опорных.




рис. 2

Этот сдвиг фазы линейно зависит от опорного напряжения на
неинвертирующем входе компаратора U2, и положение движка R4 может быть
откалибровано в единицах измерения фазы, причем напряжению Vcc/3 соответствует
0°, a 2Vcc/3-180°. Поскольку триггер имеет два выхода, QB и QB, от схемы можно
получить сигнал как с опережением по фазе, так и с отставанием относительно
опорного.

Генераторы импульсов на цифровых КМОП микросхемах

Так, товарищи! Заканчиваем банкет, убираем рыбные закуски.

Не забываем, что на сегодняшнем мероприятии, посвящённом Дню пивовара России, мы обсуждаем наболевшее:
«Исследование разнообразных схемотехнических построений и характеристик генераторов на ИМС структуры КМОП».

Развиваем сюжетную линию, плавно переходим к генераторам прямоугольных импульсов с несимметричной формой сигнала,
а также генераторам с изменяемой скважностью выходных импульсов.

Для начала определимся — для чего, собственно, когда и с чем потреблять само понятие «скважность импульсного сигнала»?



Тут как нельзя всё просто:   Скважность = Т/tи, где

Т-полный период колебаний,

tи — длительность импульса,

tп — длительность паузы.

При величине скважности, равной 2, импульсный сигнал имеет симметричную форму (меандр), во всех остальных случаях —
несимметричную (не меандр).Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники


Рис.1

Теперь также плавно, без рывков и резких падений, переходим с схемотехническим изыскам.

Отличие несимметричных генераторов от устройств, описанных на предыдущей странице, как правило, сводится к утяжелению
схемы дополнительным резистором и парой диодов для разделения цепей заряда конденсатора разнополярными токами.














Рис.2




На Рис.2 приведена схема генератора импульсов с раздельной установкой длительности импульса и паузы между ними.

Параметры выходных импульсов генератора описываются следующими приблизительными формулами:

F = 0,77/((R1+R2)×C1))
Скважность импульсов = (R1+R2)/R1

Схема обладает весомым параметром потребления тока.

Значения этого параметра находятся в диапазоне от единиц до десятков мА, в зависимости от величин напряжения питания и частоты генерации.



Рис.3




Именно из-за этих соображений, рекомендуется собирать подобные схемы генераторов на цифровых микросхемах, представляющих собой
триггер Шмитта (Рис.3).

Мало того, что они просты в реализации, так ещё и исключительно экономичны — при напряжении питания
менее 6 В ток потребления составляет всего несколько десятков микроампер.

Частота генерации и скважность для приведённой схемы:

F = 0,86/((R1+R2)×C1))
Скважность импульсов = (R1+R2)/R1



Рис.4



В случае необходимости получить плавную регулировку скважности при неизменной частоте имеет смысл обратить внимание на схему, приведённую
на Рис.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники 4.
F = 0,77/((2*R1+R2)×C1))
Макс. скважность импульсов = R2/R1+2
Мин. скважность импульсов = 1+R1/(R1+R2)



Рис.5




Точно таким же образом реализуется плавная регулировка скважности для схем, построенных на триггере Шмитта (Рис.5).

F = 0,86/((2*R1+R2)×C1))
Макс. скважность импульсов = R2/R1+2
Мин. скважность импульсов = 1+R1/(R1+R2)



Формулы для расчёта частоты рассматриваемых генераторов соответствуют напряжению питания 5В и температуре окружающей среды 25°С.

Все представленные схемы могут быть реализованы на элементах И—НЕ, ИЛИ—НЕ, триггерах Шмитта, или инверторах.

Идём дальше к таблице для расчёта номиналов элементов генераторов, исходя из заданной частоты генерации и скважности
выходных импульсов.

ТАБЛИЦА РАСЧЁТА НОМИНАЛОВ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНЕРАТОРОВ НА КМОП МИКРОСХЕМАХ БЕЗ ПЛАВНОЙ РЕГУЛИРОВКИ СКВАЖНОСТИ.

Бросив беглый взгляд на Рис.1, легко заметить, что значение скважности импульсов должно быть больше 1.

Теоретически величины сопротивлений резисторов R1 и R2 должны быть не менее 1кОм, однако на практике,
для минимизации влияния выходного сопротивления микросхемы на частоту сигнала, рекомендуется выбирать значения сопротивления
этих резисторов — не менее 10кОм. Поэтому послеживайте за рассчитанным значением R2, если оно не вписывается в нужный диапазон —
повышайте номинал R1.

И под занавес —

ТАБЛИЦА РАСЧЁТА НОМИНАЛОВ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНЕРАТОРОВ НА КМОП МИКРОСХЕМАХ C ПЛАВНОЙ РЕГУЛИРОВКОЙ СКВАЖНОСТИ.

R1 — не менее 1кОм, желательно — не менее 10кОм.

Пределы изменения длительности импульса — больше 1.





Генератор импульсов прямоугольной формы Г5-99 — Нижегородское научно-производственное объединение имени М.

Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники В. Фрунзе

НАЗНАЧЕНИЕ

Генератор импульсов прямоугольной формы микросекундного диапазона Г5-99 является лабораторным измерительным прибором и обеспечивает на внешней нагрузке (50±1) Ом формирование одинарных или парных прямоугольных импульсов периодической последовательности положительной или отрицательной полярности с изменяемыми временными и амплитудными параметрами.

Генератор Г5-99 одноканальный прецизионный по периоду повторения.

Генератор предназначен для регулировки,  испытания и поверки импульсной и другой радиоэлектронной аппаратуры и может быть использован в радиолокации, измерительной технике, связи.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ























Показатели

Величины

Длительность основных одинарных или парных импульсов

20 нс – 50 мс

Амплитуда основных импульсов на внешней нагрузке с сопротивлением (50 ± 1) Ом

0,5 — 50 В

Период повторения основных одинарных импульсов

0,5 мкс – 10 с

Временной сдвиг основного одинарного импульса относительно синхроимпульса

0 — 5 с

Длительность фронта основного импульса

≤ 10 нс

Длительность среза основного импульса

≤ 20 нс

Минимальная скважность основных одинарных импульсов

≤ 20

Режим запуска

— внутренний

— внешний

— разовый механический

Режим работы

— одинарных импульсов

— парных импульсов

Два синхроимпульса V0 ,  V1

Основные погрешности:

Длительности основных импульсов при:           

τ = 100 нс – 50 мс                                       

τ = 20 нс – 99 нс

где τ – длительность основных импульсов

±(0,03τ + 6 нс)

±(0,1τ + 10 нс)

Амплитуды  основных импульсов

±0,1 А

Периода повторения

не более ±1· 10-6Т

Временного сдвига

±(3·10-6D + 10 нс)

Средняя наработка на отказ

не менее 10000 ч

Диапазон рабочих температур

от 5°С до 40°С

Питание от сети переменного тока

220 В, 50 Гц

Потребляемая мощность

не более 130 В·А

Габаритные размеры

327х320х173 мм

Масса

8,1 кг

* Производство — Филиал Курский завод «Маяк»

Схема генератора импульсов регулируемой ширины

Биполярные симметричные импульсы регулируемой ширины позволяет получить генератор импульсов по схеме на рис.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники 1. Устройство может быть использовано в схемах авторегулирования выходной мощности импульсных источников питания. На микросхеме DD1 (К561ЛЕ5/К561 ЛАТ) собран генератор прямоугольных импульсов со , равной 2.

Симметрии генерируемых импульсов добиваются регулировкой резистора R1. Рабочую частоту генератора (44 кГц) при необходимости можно изменить подбором емкости конденсатора С1.

Рис. 1. Схема формирователя биполярных симметричных импульсов регулируемой длительности.

На элементах DA1.1, DA1.3 (К561КТЗ) собраны компараторы напряжения; на DA1.2, DA1.4 — выходные ключи. На входы компараторов-ключей DA1.1, DA1.3 в противофазе через формирующие RC-диодные цепочки (R3, С2, VD2 и R6, C3, VD5) подаются прямоугольные импульсы.

Заряд конденсаторов С2, C3 происходит по экспоненциальному закону через R3 и R5, соответственно; разряд — практически мгновенно через диоды VD2 и VD5. Когда напряжение на конденсаторе С2 или C3 достигнет порога срабатывания компараторов-ключей DA1.1 или DA1.3, соответственно, происходит их включение, и резисторы R9 и R10, а также управляющие входы ключей DA1.2 и DA1.4 подключаются к положительному полюсу источника питания.

Поскольку включение ключей производится в противофазе, такое переключение происходит строго поочередно, с паузой между импульсами, что исключает возможность протекания сквозного тока через ключи DA1.2 и DA1.4 и управляемые ими транзисторы преобразователя, если генератор двухполярных импульсов используется в схеме импульсного источника питания.

Плавное регулирование ширины импульсов осуществляется одновременной подачей стартового (начального) напряжения на входы компараторов (конденсаторы С2, C3) с потенциометра R5 через диодно-ре-зистивные цепочки VD3, R7 и VD4, R8. Предельный уровень управляющего напряжения (максимальную ширину выходных импульсов) устанавливают подбором резистора R4.

Сопротивление нагрузки можно подключить по мостовой схеме — между точкой соединения элементов DA1.2, DA1.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники 4 и конденсаторами Са, Сb. Импульсы с генератора можно подать и на транзисторный усилитель мощности.

При использовании генератора двухполярных импульсов в схеме импульсного источника питания в состав резистивного делителя R4, R5 следует включить регулирующий элемент — полевой транзистор, фотодиод оптрона и т.д., позволяющий при уменьшении/увеличении тока нагрузки автоматически регулировать ширину генерируемого импульса, управляя тем самым выходной мощностью преобразователя.

В качестве примера практической реализации импульсных источников питания приведем описания и схемы некоторых из них.

Высоковольтный 8-канальный генератор произвольных импульсов WFG600

Высоковольтные генераторы импульсов произвольной формы

Высоковольтный 8-канальный генератор произвольных импульсов WFG600

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ

Многоканальный высоковольтный генератор сигналов с компьютерным управлением WFG600 — это исключительный прибор, разработанный в первую очередь для экспериментов по адресации жидкокристаллических устройств и наиболее подходящий для всех приложений, где требуются синхронизированные последовательности импульсов с переменной шириной и амплитудой.

WFG600 можно заказать в 8-канальной версии, 2-канальной версии (или любой другой версии) с выходами ± 100 В, которые соответствуют нашему усилителю F10A в стандартной комплектации. В качестве альтернативы 8-канальная версия может быть произведена с выходами ± 200 В. Также можно заказать 4-канальную модель ± 400 В, где каждый канал соответствует нашему усилителю A800 (даже 8 каналов, но в большем корпусе). Другие конфигурации могут быть подготовлены по запросу.

Генератор сигналов WFG600 обеспечивает произвольную
размещены триггерные импульсы и могут запускаться извне.Он может работать в
один непрерывный и два пакетных режима. Суммирующий модуль выдает низковольтный
суперпозиция двух выбранных сигналов.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Благодаря уникальной концепции двойной памяти
формы сигналов можно изменять во время работы. Каждый выходной канал содержит
очень быстрый высоковольтный усилитель.

Генератор сигналов WFG600 управляется компьютером PC-Windows® (NT, 2000, XP, Vista, 7, 10) или Macintosh® под управлением OS9. Для связи используется стандартный последовательный интерфейс. Осциллограммы графически редактируются на экране.Две формы сигнала и их суперпозиция отображаются одновременно, остальные доступны через всплывающие меню. Функциональные отношения между импульсами в осциллограммах и между временными шагами могут быть запрограммированы, чтобы избежать повторных ручных настроек. Формы сигналов можно объединять в группы, чтобы обеспечить синхронную регулировку амплитуды. Данные осциллограмм также можно обменивать с помощью программы для работы с электронными таблицами. Генератор сигналов WFG600 поставляется с программным обеспечением для сред Windows и Macintosh, а также с библиотекой VI для LabVIEW®.Программное обеспечение можно бесплатно загрузить для ознакомления. Все элементы пользовательского интерфейса объясняются на снимке экрана Macintosh и экрана Windows.

Различия между генератором сигналов WFG600 и типичным генератором сигналов произвольной формы

Генератор сигналов произвольной формы (AWG) обычно имеет только
один выходной канал. Генератор сигналов WFG600 — многоканальное устройство.

Выходной сигнал AWG — низковольтный и
усилитель требуется чаще всего.Генератор сигналов WFG600 имеет очень быстрое
в каждый канал встроен высоковольтный усилитель. Амплитуда на выходе не зависит
нагрузки (в текущих пределах).

Все генераторы AWG строят свои сигналы из многих одинаково
разнесенные точки. Такой подход хорошо подходит для генерации аналоговых сигналов типа
«Имитация сердцебиения». Генератор сигналов WFG600 разработан для
производят последовательности импульсов, и каждый импульс имеет свою ширину. Таким образом, формы волны могут быть
создаются и изменяются быстрее, проще и требуют меньше места в памяти.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники

В AWG изменения вносятся непосредственно в форму волны.
генерируется, что приводит к некоторым переходным состояниям. Чтобы предотвратить это,
Генератор сигналов WFG600 включает два эквивалентных набора памяти. В любое время,
один из них используется исключительно для генерации сигналов и не зависит от
процедура редактирования. Вместо этого изменения направляются в другую память.
набор. Когда новая форма волны подготовлена ​​и старая форма достигла своего конца,
наборы памяти меняются местами. Такая подкачка памяти не вызывает никаких задержек и
выполняется одновременно по всем каналам.

Доступное программное обеспечение для AWG очень проблематично
использовать при создании импульсных последовательностей. Аппаратное и программное обеспечение WFG600
Генератор сигналов был разработан одновременно и оптимизирован для этого.
цель. Например, можно определить логические отношения между импульсами и
сложные изменения могут быть выполнены одним щелчком мыши.

Общие технические характеристики

Режимы работы

Непрерывный

Непрерывный с подсчетом кадров

Последовательность одного кадра

Пакетный один кадр с инверсией формы сигнала

Пакет N кадров

Пакет N кадров и осциллограммы развертки

Сценарий — программируемый множественный пакет с изменением формы волны

Сценарий — программируемый множественный пакет с перезагрузкой сигналов

Мультиплексирование электродной матрицы

Выходы

Два контакта BNC для высоковольтного выхода на каждом канале

Импульсный бит управления (уровень TTL) индивидуально на каждом канале

Импульс запуска осциллографа (уровень TTL, возможно несколько точек запуска)

Сигнал «Генератор работает» (уровень TTL)

Низковольтное наложение двух выбранных форм сигнала (для контроля на осциллографе)

Входы

Внешние часы

Внешний триггер

Управление Пуск / Удержание

Управление передним / обратным ходом

Компьютерное управление

серийный (RS232)

57600 бод, 8 бит, N, 1

Сроки

Базовые часы

20 МГц (управление кристаллом, 1 единица времени = 50 нс)

1 МГц (управление кристаллом, 1 единица времени = 1 мкс)

1 кГц (программное управление, настраивается с шагом 1 мс)

внешние часы (TTL, прямоугольная волна)

Минимальная ширина импульса

3 единицы времени

Разрешение по ширине импульса

3 ÷ 32767 тактовых единиц шириной (разрешение 15 бит).Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Ширину каждого импульса можно настроить индивидуально.

Максимальное количество импульсов

12288

Амплитуда

Максимум

± 100 В, 185 мА (возможны другие конфигурации)

Выходное сопротивление

<0.1 Ом

Нагрузка

резистивный || емкостный

Скорость нарастания

400 В / мкс

Разрешение

12 бит (или 50 мВ на высоковольтном выходе)

Точность

± 1 LSB или <2% уставки, ограничено временем установления.Установленная амплитуда не зависит от нагрузки в пределах тока

Примечание

Каждый выходной канал соответствует высоковольтному усилителю F10A. См. Страницу F10A для получения полной спецификации и графика пропускной способности. В качестве альтернативы характеристики усилителя А400 или А800 для других версий.

Условия эксплуатации

Температура окружающей среды от 0 ° C до 40 ° C (работа), от 0 ° C до 60 ° C (хранение)
Относительная влажность до 90% (работа), от 30% до 50% (хранение)
Время прогрева не требуется
Требования к питанию 100/110 В или 220/230 В, 50 ÷ 60 Гц
Страна происхождения Швеция

Просмотрите наши пакеты приложений, чтобы узнать о конкретных требованиях к тестам, а затем сообщите нам, что еще вам нужно.

Отправить запрос о продукте

Генерировать импульсы для двенадцатиимпульсного и шестиимпульсного тиристора
преобразователи

Simscape / Электрооборудование / Специализированные силовые системы / Силовая электроника / Силовая электроника
Управление

Описание

Блок генератора импульсов (тиристор) генерирует две последовательности импульсов.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Этот контроль
двенадцатипульсный тиристорный преобразователь на двух трехфазных двухполупериодных тиристорных мостах
(также называемые мостами Гретца). В установившемся режиме каждая последовательность импульсов состоит из
шесть равноудаленных прямоугольных импульсов со сдвигом между ними 60 градусов.

Первый набор импульсов (PY) отправляется на шестиимпульсный мост
подключен к вторичной обмотке типа звезда (Y) преобразователя Y / Y / Delta
трансформатор. Второй набор импульсов (PD) отправляется на шестиимпульсный
мост соединен с треугольником вторичной обмотки трансформатора преобразователя.Импульсы частичного разряда можно настроить так, чтобы они опережали или отставали от импульсов частичного разряда на 30 электрических величин.
градусов, в зависимости от конфигурации соединения треугольником
преобразователь трансформатор.

На следующем рисунке показан пример генератора импульсов (тиристора).
блок, подключенный к двенадцатиимпульсному тиристорному преобразователю.

Блок генератора импульсов (тиристор) может быть запрограммирован для управления
шестиимпульсный тиристорный преобразователь, состоящий из одного трехфазного двухполупериодного
тиристорный мост. В этой конфигурации последовательность импульсов частичного разряда не
генерируется, и блок выводит только последовательность импульсов PY.Пульс
поезд, переименованный в P, подходит для моста Гретца, подключенного к преобразователю
трансформатор, без сдвига фаз между первичной и вторичной обмотками.

Порядок следования импульсов в последовательностях импульсов соответствует естественному
порядок коммутации трехфазного тиристорного моста, как показано на
следующий рисунок.

В таблице ниже приведены коммутирующие напряжения для тиристоров в зависимости от трансформатора.
связь. Подключение трансформатора отражает фазовый сдвиг между источником переменного тока.
и тиристоры.

Тиристор, подлежащий зажиганию 1 ​​ 2 3 4 5 6
ex Тиристор 5 1 ​​ 2 3 4
Коммутирующее напряжение для соединения YY Vac Vbc Vba Vca Vcb Vab
(для a отставание) -Vc Vb-VA Vc -Vb VA
для Y-D11 (ведущий) VA -Vc Vb -Va

Vc -Vb

Блок генератора импульсов (тиристор) управляется альфа
опорным сигналом угла и сигналом синхронизации wt .Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Сигнал wt представляет собой угол, изменяющийся от 0 до 2 * пи радиан, синхронизированный
на переходах через нуль основной (прямой) фазы
А первичного напряжения преобразователя трансформатора. Сигнал wt
обычно получается из системы фазовой автоподстройки частоты (ФАПЧ).

Блок генератора импульсов (тиристор) генерирует внутренний вес
рампы для управления импульсами. Угол задержки альфа выражается в
электрические градусы, на которые импульс задерживается относительно угла
ноль его коммутирующего напряжения.На рисунке показано, как пульс PY
поезд сформирован.

Блок генератора импульсов (тиристор) можно настроить для работы
в двухимпульсном режиме. В этом режиме на каждый тиристор подается два импульса:
первый импульс при достижении альфа-угла, а затем второй импульс
60 градусов спустя, когда сработает следующий тиристор. Этот рисунок показывает
двойные импульсы в серии импульсов PY.

Простой генератор импульсов с малым счетчиком деталей

Аннотация: Используя несколько операционных усилителей и несколько внешних компонентов, вы можете создать генератор импульсов с регулируемой частотой и скважностью.

Естественным выбором для генерации импульсов переменной частоты и рабочего цикла является хороший настольный генератор импульсов. Однако, если у вас нет генератора или вы должны встроить его в свою систему, вы можете сделать это с помощью нескольких операционных усилителей и некоторых внешних компонентов (, рисунок 1, ).

Рис. 1. Этот простой и универсальный генератор импульсов состоит всего из 15 компонентов.

U1 и Q1 образуют генератор, управляемый напряжением (ГУН) с прямоугольным и треугольным выходом.Прямоугольная волна используется для управления зарядом и разрядом интегрирующего конденсатора C1, а также может использоваться в качестве выхода синхросигнала. Треугольная волна управляет неинвертирующим входом контроллера рабочего цикла U2-2. R2 полностью регулирует рабочий цикл выхода (от 0% до 100%), управляя инвертирующим входом U2-2.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники U2-2 напрямую генерирует выходной сигнал.

U2-1 буферизует напряжение стеклоочистителя R1, которое регулирует частоту ГУН. Изменение напряжения питания (V +) изменяет размах выходного сигнала, не влияя на выходную частоту или рабочий цикл, и схема работает одинаково хорошо как с одним, так и с двумя источниками.Показанный диапазон частот составляет от 20 Гц до 13 кГц, но вы можете изменить этот диапазон, изменив значение C1. Двойные операционные усилители (предназначенные для управления усилителями мощности) выбраны из-за их высокой выходной мощности, возможности прямого ввода-вывода, работы с одним источником питания и исключительной разомкнутой цепи.

Аналогичная версия этой статьи появилась в номере журнала EET от 20 января 2003 года.

©, Maxim Integrated Products, Inc.

Содержимое этой веб-страницы защищено законами об авторских правах США и зарубежных стран.Для запросов на копирование этого контента свяжитесь с нами.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1960:

ПРИМЕЧАНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

1960 г.,
AN1960,
АН 1960,
APP1960,
Appnote1960,
Appnote 1960

maxim_web: ru / products / аналоговые / усилители

maxim_web: ru / products / аналоговые / усилители

Генератор импульсов

для шагового контроллера с использованием AD654

Этот проект шагового генератора импульсов представляет собой простое решение для привода с шаговым контроллером. Это очень важный инструмент, который можно использовать для управления шаговым двигателем в автономном режиме.Он генерирует прямоугольные импульсы в диапазоне частот 0-50 кГц. В этом проекте есть несколько функций, которые необходимы для шагового контроллера. Он имеет встроенный частотный генератор с широким диапазоном частот, ползунковый переключатель для управления направлением и перемычку для включения или отключения шагового контроллера.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники AD654 является сердцем проекта и генерирует импульс для шагового контроллера, выходная частота 0-50 кГц, возможен выход более высокой частоты, изменяя значение конденсатора ТТ, подключенного между контактами 6 и 7.См. Технические данные AD654 для изменений. AD654 — это монолитный преобразователь напряжения в частоту, состоящий из входного усилителя, прецизионной системы генератора и сильноточного выходного каскада. Плата имеет на борту регулятор LM317 и имеет входное питание 7-36В постоянного тока. Встроенный светодиод для индикации мощности, подстроечный потенциометр PR2 для установки частоты. PR1 предназначен для точной настройки частоты, ползунковый переключатель SW1 для изменения направления шагового двигателя, перемычка J1 для включения или отключения шагового контроллера.Все выходы уровня TTL. Измените R3 на 0E, если шаговый контроллер имеет вход оптопары.

Этот генератор импульсов работает вместе с драйвером биполярного шагового двигателя 2,5 А LV8772E, но не ограничивается им.

Характеристики

  • Питание 7-36 В постоянного тока
  • Частотный выход 0-50 кГц (уровень TTL)
  • Уровень TTL сигнала направления, измените R3 на 0 Ом для прямого выхода 5 В
  • Включить — GND или 5 В
  • D1 Индикатор питания
  • PR1 Точная настройка выходной частоты
  • PR2 Регулировка частоты
  • Ползунковый переключатель SW1 для направления
  • J1 — Перемычка для включения или отключения шагового контроллера

Схема

Список запчастей

Подключения

Фото

Видео

BNC Модель DB-2

ВХОДЫ и ВЫХОДЫ

Внешний триггер: положительный импульс 1 В запускает импульс (одинарный или двойной) с включенными внутренними регуляторами задержки и ширины.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Входное сопротивление 50 Ом, максимальное входное сопротивление +/- 5 В.

Привод: положительный импульс 1 В генерирует выходной импульс с шириной, равной ширине входящего импульса, работают регуляторы внутренней задержки и ширины. Входное сопротивление 50 Ом, максимальное входное сопротивление +/- 5 В.

Внутреннее / внешнее задание: при использовании внутреннего задания амплитуда выходного импульса регулируется только элементами управления «Амплитуда» и «Нормализация». С внешнего опорного сигнала, приложенное положительных контролей уровне амплитуды выходного импульса.

Вход: +5 В макс., Входное сопротивление 5 кОм.

Выходная амплитуда:

Flat Top: от 0,0 В до 2 В на 50 Ом, от 0,0 В до 4 В на высоком импедансе, плавно регулируется с помощью десятиоборотного потенциометра. Импеданс источника 50 Ом.

Хвостовой импульс: от 0,0 В до 1,5 В на 50 Ом, от 0,0 В до 3 В на высоком импедансе, плавно регулируемый с помощью десятиоборотного потенциометра. Импеданс источника 50 Ом.

Полярность: возможны одновременные положительные и отрицательные импульсы.

Триггерный выход: положительный импульс 3 В, время нарастания 10 нс, выходное сопротивление 50 Ом.

ОБЩИЕ

Амплитудные характеристики: Температурная стабильность: отклонение менее 1% от 0-50 ° C.

Варианты рабочего цикла: от менее 1% до 90% коэффициента заполнения.

Линейность: интегральная нелинейность менее 1%.

Требования к питанию: +12 В при 500 мА, -12 В 400 мА, + 6 В при 80 мА, -6 В при 425 мА.

ОРГАНЫ УПРАВЛЕНИЯ

Единый цикл: один импульс возникает каждый раз, когда нажимается кнопка.

Нормализация: многооборотный потенциометр изменяет амплитуду до 50%.

Время нарастания (10-90%):

Хвостовой импульс: от 3 нс до 250 нс за шесть шагов.

Flat Top: от 4 нс до 250 нс за шесть шагов.

Постоянная времени затухания (100–37%): от 5 нс до 10 мкс за восемь шагов.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники

Частота: A: от 10 Гц до 50 МГц, плавная регулировка с грубым и точным управлением. B: Внешний запуск, от 0 Гц до 50 МГц

Задержка: 10 нс — 10 мс, плавная регулировка с грубым и точным управлением.

Ширина: 5 нс — 5 мс, плавная регулировка с грубым и точным управлением.

Импульс с плоской вершиной / хвостом: тумблерный переключатель выбирает форму выходного импульса. Элементы управления шириной работают только в режиме с плоским верхом.

Одиночный / двойной импульс: в одноимпульсном режиме возникает одиночный выходной импульс, который задерживается от триггерного выхода на величину, определяемую элементами управления задержкой.

В двухимпульсном режиме появляются два выходных импульса одинаковой ширины. Первый импульс одновременен с выходом триггера.Разделение импульсов устанавливается регуляторами задержки.

ФИЗИЧЕСКИЕ

Размер: Модуль NIM тройной ширины 4,05 дюйма в ширину и 8,70 дюйма в высоту в соответствии с TID-20893 (Rev. 3).

Вес: 4,5 фунта. (2 кг) нетто; 7 фунтов. (3,2 кг) доставка.

Импульсный

Развитие линейки генераторов импульсов в 1960-е и 1970-е годы

Ранние генераторы импульсов были разработаны для удовлетворения очень простых потребностей лабораторий 1940-х и 1950-х годов.Их использование ограничивалось моделированием электрических явлений, запуском осциллографов или проверкой времени нарастания усилителя. Эволюция этих простых первоначальных требований была вызвана увеличением количества новых технологий, требующих все более точной и сложной генерации импульсных сигналов. В начале шестидесятых радар, телевидение и кабельное телевидение были первыми приложениями, которые расширили линейку генераторов импульсов. Эти быстрорастущие рынки побудили HP предоставить широкий спектр инструментов, позволяя заказчику выбрать генератор импульсов, точно соответствующий его потребностям в тестировании.Генератор с регулировкой импульсов: портал и журнал для разработчиков электроники Затем, к середине шестидесятых, появился еще один совершенно новый рынок — рынок компьютеров. Для этого потребовались генераторы импульсов с характеристиками, специально предназначенными для компьютерных технологий. Этот новый тип генератора импульсов быстро адаптировался к конкретной задаче стимуляции логической схемы. В семидесятых годах появилась новая категория генераторов импульсов: генератор двоичных слов. Генераторы слов используются для создания сигналов сложной формы, необходимых для тестирования логических схем, разработки телекоммуникационных систем и моделирования интерфейсов.

Различные генераторы импульсов HP, с начала 1940-х до конца 1970-х годов
Нажмите на картинку для получения подробной информации

Генератор импульсов HP 215A

HP 215A

HP 215A был представлен в кратком каталоге 1962 года как «единственный на сегодняшний день генератор импульсов, сочетающий время нарастания и затухания в 1 нс с удобством калиброванного, непрерывного управления длительностью и задержкой импульса.«

К началу 60-х годов прошлого века такая производительность была новой проблемой, которая требовалась в основном на развивающемся потребительском рынке полупроводников. Измерение времени переключения и восстановления диодов, транзисторов, логических схем и модулей тонкопленочной памяти становилось серьезной проблемой.
Этот универсальный новый генератор импульсов, который выдает импульсы длительностью до 1 наносекунды (10-E9 секунд), также способствовал исследованиям быстрых схем.

Анализатор 215A в сочетании с «Киломегацикловым осциллографом», представленным в марте 1962 г., представляет собой полную систему тестирования с быстродействием схемы для обычных тестов типа «стимул-реакция».

Деталь передней панели HP 215A

Обычные методы генерации импульсов с наносекундным временем нарастания не были достаточно гибкими для генератора импульсов общего назначения в 1962 году. Основная трудность заключалась в поддержании постоянной высоты импульса, наряду с предписанными временами нарастания и спада, при варьировании ширины импульса. Проблема была решена в модели 215A путем получения импульса из двух очень быстрых шагов тока, одной положительной и одной отрицательной, генерируемых в отдельных каналах.Быстрое время нарастания этих ступеней и, следовательно, импульса, полученного на их основе, является результатом использования диодов ступенчатого восстановления в качестве «усилителей резкости» импульсов, как показано на блок-схеме ниже.

Принципиальная схема генератора импульсов HP модели 215 A.

HP 214A

HP 214A

Генератор импульсов HP 214A, High-Power, Fast-Rise, был представлен в общем каталоге 1963 года.

Импульсы с быстрым нарастанием и значительной мощностью при высокой частоте повторения были необходимы для удовлетворения большого спроса во все возрастающем количестве приложений к началу 1960-х годов. Испытания магнитных сердечников, ферритовых модуляторов, высокоскоростных реле и полупроводниковых устройств большой мощности представляют собой некоторые из применений импульсов значительного тока. Импульсы с большим напряжением полезны для проверки усилителей мощности, широкополосных модуляторов и времени ионизации неоновых ламп, тиратронов и других газовых устройств.

Чтобы удовлетворить этот спрос на импульсы большой мощности, генератор импульсов модели 214A был разработан для обеспечения выходной мощности до 200 Вт при частоте следования до 1 Мгц. Максимальная амплитуда импульса на нагрузке 50 Ом составляет 100 В, что в четыре раза превышает мощность, ранее доступную в генераторе импульсов общего назначения. Максимальный импульсный ток при коротком замыкании — 2 ампера. Время нарастания и спада импульса при 100 В обычно составляет менее 15 нсек и сокращается до менее 13 наносекунд для амплитуды импульса 50 В (на 50 Ом) или меньше.

Генератор импульсов модели 214 A, обеспечивающий до 2 ампер импульсного прямого тока, внес большой вклад в исследование световых спектров, излучаемых электролюминесцентными диодами, которые к началу 1960-х годов находились на очень ранней стадии разработки.

Используйте колесо прокрутки для увеличения / уменьшения масштаба

Щелкните и перетащите, чтобы просмотреть другие части изображения при увеличении

Генератор импульсов 214A, вид сверху и изнутри

HP 211B

HP 211B,

Расширяя линейку генераторов импульсов до недорогих устройств общего назначения, HP 211B был включен в общий каталог 1967 года.

Модель 211B — это компактный, полностью транзисторный генератор прямоугольных импульсов для лабораторных и производственных линий общего назначения. Он обеспечивает частотный охват от 1 Гц до 10 МГц в семи декадных диапазонах с линейно откалиброванным циферблатом для непрерывной регулировки во всех положениях.

Прямоугольные волны или импульсы?

Основное различие между генераторами импульсов и прямоугольных импульсов касается рабочего цикла сигнала. Генераторы прямоугольных сигналов имеют равные периоды «ВКЛ» и «ВЫКЛ», это равенство сохраняется при изменении частоты повторения.С другой стороны, длительность периода «ВКЛ» генератора импульсов не зависит от частоты следования импульсов. Рабочий цикл генератора импульсов можно сделать достаточно низким, чтобы эти инструменты, как правило, могли выдавать больше энергии во время периода «ВКЛ», чем генераторы прямоугольных импульсов.

Короткие импульсы уменьшают рассеиваемую мощность в тестируемом компоненте или системе. Например, измерения усиления транзистора производятся с помощью импульсов, достаточно коротких, чтобы предотвратить нагрев перехода и последующее воздействие тепла на усиление транзистора.

Генераторы прямоугольных сигналов используются там, где важны низкочастотные характеристики системы, например, при тестировании аудиосистем. Прямоугольные волны также предпочтительнее коротких импульсов, если переходной характеристике системы требуется некоторое время, чтобы успокоиться.

HP 8406A

Гребенчатый генератор HP 8406A

Даже если отнести 8406A к категории приборов с генераторами импульсов неочевидно, в основном это генератор импульсов.Впервые он появился в каталоге 1967 года, в котором он был представлен как удобный и точный прибор для калибровки частоты для HP Model 851A / 8551A (широкополосный анализатор спектра).

Гребенчатый генератор 8406A имеет три внутренних генератора с кварцевым управлением на частотах 1, 10 и 100 МГц, а также ступенчатый восстанавливающий диод, который формирует выходные сигналы генератора в чрезвычайно узкие импульсы шириной менее 100 пикосекунд. В результате создается гребенка частот маркеров с полезной амплитудой от 1 МГц до 5 ГГц.

Хотя это не совсем полезно с синтезированным анализатором спектра, подобным показанному ниже, цель этого изображения — показать гребенку импульсов, выводимых из 8406A в одном диапазоне 10 ГГц. Точно разделенные маркеры на 1, 10 или 100 МГц были единственным способом проверить калибровку горизонтальной частоты аналогового анализатора спектра. HP 8406A был ценным и недорогим инструментом для инженеров, использовавших 8551 в 1960-х или 8558 в 1970-х. И тем более ценно для техников по обслуживанию, которым приходится настраивать схему формирования зубьев пилы такого анализатора.

Гребенчатый генератор HP 8406A
Картинка для изображения с высоким разрешением на дисплее анализатора спектра

HP 8003A

HP 8003A,

Представленный в 1968 году, HP 8003A был первым генератором импульсов высокого давления, предлагающим возможность дистанционного программирования частоты повторения, ширины импульса и амплитуды выходного сигнала.Задолго до появления стандартизированного компьютерного интерфейса опция 01 в 8003A позволяла программировать эти основные параметры путем простого замыкания контакта на землю.

В 1968 году, через два года после появления модели 2116, первый компьютер HP интегрировал все больше и больше инструментов в автоматизированные системы. Тем не менее, всего за 5 лет до рождения HP-IB, этот компьютер первого поколения потребовал добавления одной выделенной интерфейсной карты для каждого инструмента, управляемого системой.Последняя ступень в большинстве этих интерфейсов обеспечивала замыкание контактов через переход эмиттер-коллектор выходного транзистора.

Основные характеристики 8003A: время нарастания 5 нс, частота повторения 10 МГц и одновременный положительный и отрицательный выход при максимальном уровне 5 В на 50 Ом.

Коллекция памяти HP Импульсная система HP 1900A, загруженная слева направо,
, генератор скорости 1905A, генератор задержки 1908A и выходной сигнал переменного времени перехода 1917A

HP 1900A

HP 1900A,

Базовый блок модульного генератора импульсов 1900A, представленный в 1969 году, стал еще одним шагом к цели создания импульсных систем, адаптированных к точным требованиям, от общего лабораторного использования до полностью автоматизированных производственных испытательных систем.

Полностью твердотельный мэйнфрейм системы 1900A содержит только источники питания, при желании можно добавить дополнительную проводку для программирования. Съемный отсек принимает любую комбинацию вставных модулей половинного или четвертого размера.

Три подключаемых модуля были доступны при первом выпуске в 1968 году. Генератор частоты 1905A был источником синхронизации, обеспечивающим триггеры на выходе с частотой повторения от 25 Гц до 25 МГц. Импульсы от 1905A с частотой до 25 МГц могут быть продвинуты или задержаны с помощью генератора задержки модели 1908A в диапазоне от 15 нс до 10 мс.Выходной усилитель с регулируемым временем перехода модели 1915A обеспечивает мощные выходные импульсы с регулируемым временем нарастания и спада.

Позже, в 1969 году, были представлены новые плагины, которые были описаны в мартовском выпуске журнала Hewlett Packard Journal за 1969 год. Среди них, модель 1925A, дала системе 1900A возможность генерировать «СЛОВА» для цифрового тестирования, что сделало Model 1900A первым прибором HP, который представил концепцию генерации логических слов. Как мы знаем сегодня, инновация, которая будет иметь огромный успех в последующие годы.

HP 8012B

HP 8012B

Расширение линейки генераторов импульсов в 1970-х годах было вызвано в основном потребностью в приборах, способных тестировать высокоскоростные логические схемы, такие как ECL и Schottky-TTL. Исчерпывающий перечень продуктовой линейки генераторов импульсов, доступной в HP к концу семидесятых годов, доступен в PDF-копии краткого каталога, посвященного генераторам импульсов, который воспроизводится ниже.

HP 8012B, показанный справа, представляет собой недорогой продукт в очень большом портфеле генераторов импульсов, производимых HP Gmbh Boeblingen Divison в 1970-х годах.

8012B — универсальное решение практически для всех задач цифрового тестирования того времени. Он обеспечивает переменное время перехода до 5 нс, что идеально подходит для тестирования интегральных схем TTL. Частоту повторения можно регулировать от 1 Гц до 50 МГц, а выходная схема может выдавать амплитуду до ± 10 В на нагрузку 50 Ом.8012B также имеет двухимпульсный и прямоугольный режим работы.

HP 8082A

HP 8082A,

Другой пример производства подразделения HP Boeblingen Division в 1970-х годах, генератор импульсов модели 8082A обеспечивает управление временем перехода в диапазоне от 1 нс до 5 мс и частотой повторения импульсов до 250 МГц.Предусмотрены два выхода, один из которых дополняет другой.

Разработка схем, которые позволяли бы контролировать время перехода до 1 нс, не вызывая чрезмерного звона или выброса, оказалась самой сложной частью проекта и потребовала применения микросхем.

Еще одной проблемой, о которой всегда думали дизайнеры HP, была простота использования прибора, в основном определяемая расположением различных элементов управления на его передней панели. Не зря в авиастроении первыми разработали панели управления, которые позволяли пилотам читать с первого взгляда и настраивать практически инстинктивно.Фактически, в других областях промышленности они все еще назывались «средствами управления самолетом». Элементы управления на большинстве генераторов импульсов от HP GmbH в Бёблингене заимствованы из этой концепции, используя элементы управления горизонтальными пазами, где задействованы горизонтальные характеристики сигналов формы волны, и вертикальные слоты, где определены такие характеристики, как амплитуда. Как показано на фотографии генератора импульсов 8082A ниже, «шкальные» ручки все еще используются, но в основном для точной настройки. По словам Йерна Коса, технического менеджера по генераторам импульсов, инженеры и конструкторы GmbH были одними из первых, кто широко использовал концепцию переключателя самолетов для электронных приборов.

Для ускорения ознакомления оператора с функциями времени ползунковые переключатели расположены горизонтально
, а переключатели, отвечающие за амплитуду импульса, расположены вертикально.

Обложка каталога импульсных генераторов 1970-х годов
Предоставлено компанией Hewlett-Packard

A Генераторы импульсов 1970-х годов

Специальный каталог

В этом каталоге можно найти исчерпывающий перечень продуктовой линейки генераторов импульсов, доступных в HP к концу семидесятых годов.В его содержании перечислены все инструменты и аксессуары, доступные к концу 1970-х годов для генерации импульсов и логических слов.

Каталог импульсных генераторов

(PDF, 4.35 Мб)

HP 5359A

HP 5359A

Трудно классифицировать, 5359A может быть внесен в категорию приборов для измерения частоты времени или в категорию синтезаторов.Однако это в первую очередь генератор импульсов. В 1978 году компания Hewlett Packard внесла его в раздел «Электронные счетчики» общего каталога.

Во второй половине 1970-х годов в новые приборы будут интегрированы микропроцессоры, и линейка генераторов импульсов не стала исключением. Вклад микропроцессора в повышение производительности заключался лишь в очевидной области точной генерации сигналов, но в большей степени в обеспечении удаленного управления каждым параметром прибора с помощью интерфейсной шины Hewlett Packard (HP-IB).С 1975 года большинство характеристик интерфейса компьютерной связи этого прибора, которые изначально были определены HP, были стандартизированы IEEE под стандартным номером IEEE-488.

Благодаря интеграции всех этих новых технологий, 5359A был первым из новой линейки генераторов импульсов с непревзойденной точностью и сверхнизким джиттером импульсов. Он будет интенсивно использоваться при создании больших испытательных систем для калибровки радаров, Loran, DME и Tacan Systems.Другими приложениями были точная генерация разверток с задержкой в ​​осциллографах и чрезвычайно точное «временное позиционирование» управление внешними вентилями на частотомерах.

Основные технические характеристики HP 5359A: Частота повторения 10 МГц макс. Цифровые задержки от 0 до 160 мс с шагом 50 пс или более. Общая точность ± 1 нс ± погрешность временной развертки и джиттер импульса менее 100 пс. Выходная амплитуда указана в диапазоне от ± 0,5 до ± 5,0 В при нагрузке 50 Ом с импедансом источника 50 Ом.

Конец 1970-х, Генераторы данных и слов

Последняя эволюция генератора импульсов и первое поколение генераторов данных и слов начали разрабатываться к концу семидесятых годов. Потребность в специализированной модели генератора импульсов возникла одновременно с анализом логических схем.

В отличие от генератора импульсов, который обычно обеспечивает непрерывные потоки импульсов, генератор слов выдает цифровые сигналы с битовым содержимым, запрограммированным пользователем.Цифровая информация обычно кодируется так, что высокий уровень или импульс представляет собой логическую единицу, а низкий уровень или отсутствие импульса представляет собой логический ноль. Таким образом, пользователь может определить свое цифровое слово как 11100110 и запрограммировать свой генератор слов на создание 3 импульсов, за которыми следуют 2 пробела, затем 2 импульса и, наконец, один пробел. Генерация слов может быть последовательной, при которой данные производятся только по одному каналу, или параллельной, при которой одновременно создается множество каналов информации. Генератор частоты повторения (тактовый генератор) и выходной усилитель обычно также включаются для создания автономного устройства, полностью способного доставлять данные на тестируемое устройство.

Один пример в каждой из трех категорий генераторов слов, данных и псевдослучайных двоичных последовательностей (PRBS) показан на рисунке ниже:

Вверху: 3760A был специально разработан для приложений связи и обеспечивает шаблоны PRBS и WORD переменной длины с частотой повторения до 150 Мбит / с.
Средний: Генератор последовательных данных 8018A, 50 Мбит / с, содержащий 2048 бит последовательной памяти, которая может быть предоставлена ​​как один канал или как 2 канала по 1024 бит каждый.Длина шаблона может составлять от 3 до 2048 бит, а поток данных может быть разделен на последовательные слова для систем тестирования, ориентированных на байты, символы или слова.
Внизу: 8016A — это 8-канальный генератор слов с частотой 50 МГц, который может подавать все сигналы, необходимые для тестирования сложных интегральных схем MSI и LSI.

Сбор данных и генераторы слов — сверху вниз:
Генератор данных HP 3762A — Генератор последовательных данных HP 8018A — Генератор слов 8016A

Усиление с импульсным управлением

— новый мощный инструмент для диагностики на месте в условиях ограниченных ресурсов

Аннотация

Фон

Молекулярная диагностика стала незаменимой при идентификации многих инфекционных и забытых заболеваний, а обнаружение нуклеиновых кислот часто служит золотым стандартом для большинства инфекционных агентов.Однако общепринятые методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют много времени и связаны с лабораторией, в то время как быстрые тесты, такие как иммунохроматографические тесты с боковым потоком, часто не обладают необходимой чувствительностью и / или специфичностью.

Методы / основные выводы

Здесь мы представляем доступный, высокомобильный альтернативный метод быстрой идентификации инфекционных агентов с использованием импульсной амплификации (PCA). PCA — это технология амплификации нуклеиновых кислот следующего поколения, в которой используются быстрые импульсы энергии для нагрева микроциклов (металлических нагревательных элементов микромасштаба, встроенных непосредственно в реакцию амплификации) в течение нескольких микросекунд, нагревая, таким образом, лишь небольшую часть реакционного объема.Нагретые микроциклы практически мгновенно охлаждаются, что приводит к сверхбыстрым циклам нагрева и охлаждения, во время которых происходит классическая амплификация целевой последовательности. Это сокращает общее время амплификации до 10 раз, обеспечивая рабочий процесс от образца к результату всего за 15 минут при работе на небольшом портативном прототипе устройства. В этом доказательстве принципиального исследования мы разработали анализ PCA для обнаружения Yersinia pestis, чтобы продемонстрировать эффективность этой технологии.Наблюдаемые пределы обнаружения составляли 434 копии на реакцию (очищенная ДНК) и 35 клеток на реакцию (неочищенный образец), соответственно, Yersinia pestis.

Выводы / Значение

PCA предлагает быструю и децентрализованную молекулярную диагностику и может применяться всякий раз, когда требуется быстрое обнаружение инфекционных агентов на месте, даже в условиях ограниченных ресурсов. Он сочетает в себе чувствительность и специфичность ПЦР с быстротой и простотой ранее существовавших быстрых тестов.

Информация об авторе

Быстрая и надежная диагностика на месте является неотъемлемой частью реагирования на вспышки инфекционных заболеваний и борьбы с забытыми тропическими болезнями. В этом отношении молекулярная диагностика представляет собой современный золотой стандарт. Однако подавляющее большинство современных методов молекулярной диагностики (таких как полимеразная цепная реакция) являются лабораторными, требуют дорогостоящего и тяжелого оборудования и требуют времени для выполнения. Более того, в странах с ограниченными ресурсами с небольшой инфраструктурой или без нее, образцы часто приходится перевозить на большие расстояния в несколько референс-лабораторий, способных проводить такую ​​диагностику.Это значительно замедляет весь диагностический процесс, тем самым значительно задерживая принятие важных решений, необходимых для сдерживания вспышек и принятия медицинских контрмер. До сих пор существует только несколько быстрых диагностических тестов на месте для ограниченного числа инфекционных агентов, и им часто не хватает чувствительности и / или специфичности. Здесь мы представляем новую технологию — амплификацию с импульсным управлением — которая обеспечивает быструю (<20 минут) и портативную, но при этом чувствительную и специфическую молекулярную диагностику на месте, основанную на амплификации нуклеиновых кислот.Разработанное нами устройство является легким, работает от батареи, и мы демонстрируем, что наши тесты могут проводиться в условиях ограниченных ресурсов и без экстракции нуклеиновых кислот, даже при использовании всех средств индивидуальной защиты. Таким образом, молекулярная диагностика может выполняться на месте в внелабораторной среде без необходимости экстракции нуклеиновых кислот. Мы предполагаем, что эта новая технология потенциально может стать золотым стандартом в области обнаружения нуклеиновых кислот для приложений на первом месте и в полевых условиях.

Образец цитирования: Müller K, Daßen S, Holowachuk S, Zwirglmaier K, Stehr J, Buersgens F, et al. (2021) Импульсное усиление — новый мощный инструмент для диагностики на месте в условиях ограниченных ресурсов. PLoS Negl Trop Dis 15 (1):
e0009114.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114

Редактор: Кристиан Э. Демер, Institut Pasteur, ФРАНЦИЯ

Поступила: 14 июля 2020 г .; Принята в печать: 7 января 2021 года; Опубликовано: 29 января 2021 г.

Авторские права: © 2021 Müller et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Автор (ы) не получил специального финансирования для этой работы.

Конкурирующие интересы: Я ознакомился с политикой журнала, и авторы SD, LU, JS и FB этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: SD работает над биорешениями GNA.LU, JS и FB — основатели и генеральные директора GNA biosolution.

Введение

Инфекционные заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы, грибы или паразиты, по-прежнему входят в первую десятку причин смерти во всем мире [1]. Быстрая и специфическая диагностика является важной опорой любого реагирования на вспышку и способна предотвратить эпидемии или даже пандемии. Одним из печально известных примеров является легочная чума, вызываемая Yersinia pestis, агентом биотерроризма категории А [2], которая может быть смертельной, если не лечить в течение 24 часов после появления симптомов.На сегодняшний день на Мадагаскаре приходится около 75% всех случаев чумы в мире. В 2017 году на Мадагаскаре произошла необычно широко распространенная эпидемия чумы, которая затронула и крупные города [3]. Во время этой вспышки иммунохроматографические экспресс-тесты использовались для децентрализованной диагностики. Однако недавно опубликованное исследование показало, что используемые тесты не обладают как чувствительностью, так и специфичностью [4]. Кроме того, единственная лаборатория, способная проводить подтверждающую диагностику, находится в столице Мадагаскара Антананариву.Из-за часто длительного времени транспортировки образцов из очагов чумы в лабораторию в сочетании с длительным контрольным тестом на основе культивирования, получение окончательных результатов может занять несколько дней [5]. Сообщалось даже о вспышках чумы в Китае, что для получения окончательных лабораторных результатов может потребоваться до 15 дней [6], что еще раз демонстрирует острую необходимость в надежной децентрализованной диагностике. Это также подтверждается Rajerison et al., Заявляя, что «улучшение всех инструментов для диагностики чумы, в том числе тех, которые подходят для скрининга на месте оказания медицинской помощи в отдаленных районах, остается приоритетной задачей исследований по борьбе с чумой среди людей» [4].Помимо риска естественных вспышек, современные угрозы биотерроризма могут привести к массовым жертвам серьезных инфекционных заболеваний и, следовательно, также требуют быстрых и надежных диагностических тестов, которые можно проводить на месте, а не в централизованной лаборатории [7]. Таким образом, в современной диагностике инфекционных заболеваний, подверженных тропическим и эпидемическим заболеваниям, быстрые диагностические тесты (ДЭТ) являются незаменимыми активами, но должны соответствовать высоким ожиданиям: они должны быть портативными и простыми в использовании, но в то же время time дает результаты с высокой чувствительностью и специфичностью за короткое время, чтобы облегчить надежный диагноз для адекватной терапии.

Анализы бокового потока (LFA) являются распространенным примером RDT и представлены в нескольких различных форматах. В принципе, все они используют иммунохроматографию для обнаружения присутствия или отсутствия определенного целевого аналита в жидкой пробе без необходимости интенсивной подготовки проб и дополнительного оборудования. Это небольшие и портативные устройства, которые обеспечивают быструю (например, 15–20 минут) результаты, тем самым перемещая диагностическое тестирование из централизованных лабораторий ближе к пациенту или даже прямо в поле.Таким образом, они стали незаменимым методом тестирования в местах оказания медицинской помощи (POC) и используются службами первой помощи во всем мире [8,9]. Однако данные о чувствительности и специфичности LFA ограничены, но в целом указывают на высокие пределы обнаружения и часто на отсутствие специфичности [4,10,11]. Кроме того, чувствительность методов обнаружения, основанных на распознавании антигена, зависит от постоянного присутствия и достаточной концентрации специфического антигена. LFAs для обнаружения Y. pestis, например, используют капсульный белок F1.Однако ген F1 регулируется температурой и экспрессируется только при ≥33 ° C, что может привести к ложноотрицательным результатам, если тесты используются в контексте окружающей среды или биотерроризма [12].

В отличие от LFA, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является высокочувствительным методом с высокой специфичностью и воспроизводимостью, и многие протоколы золотого стандарта были разработаны для широкого спектра биологических агентов. В течение последнего десятилетия было разработано множество основанных на ПЦР методов для дальнейшего улучшения диагностических возможностей, включая количественную ПЦР в реальном времени (qPCR), мультиплексную qPCR и цифровую капельную ПЦР (ddPCR) [13].Тем не менее, ПЦР в реальном времени остается трудоемкой и связанной с лабораторией техникой, обычно требующей выделения ДНК перед амплификацией и часто больших, тяжелых и энергоемких термоциклов. Системы на основе картриджей, такие как GeneXpert или BioFire FilmArray, преодолевают некоторые из этих ограничений, но по-прежнему полагаются на проводное электроснабжение, не имеют возможности обрабатывать несколько образцов одновременно и очень дороги (например, панель BioFire BioThreat, единственная панель для этого платформа, которая включает Y.pestis, стоит 150 евро за реакцию). Доступны несколько других методов амплификации нуклеиновых кислот, которые могут стать инструментами обнаружения и диагностики, в основном основанными на методах изотермической амплификации, таких как изотермическая амплификация, опосредованная петлей (LAMP). Однако для них часто требуется несколько праймеров, что сильно затрудняет обнаружение патогенов с сильно расходящимися последовательностями, таких как Filoviridae [14]. Кроме того, из-за необходимого большого количества индивидуальных праймеров эти анализы особенно склонны к образованию димеров праймеров, что в некоторых случаях даже приводит к ложноположительным результатам [15].

Чтобы устранить эти различные ограничения, существующие в существующих методах, мы представляем сверхбыстрый, но чувствительный и специфический метод обнаружения инфекционных агентов на основе нуклеиновых кислот, то есть амплификацию с импульсным управлением (PCA). В качестве доказательства концепции мы разработали PCA-анализ для обнаружения Y. pestis в стандартных лабораторных условиях с использованием как очищенной ДНК, так и неочищенного культурального материала в качестве образцов. Кроме того, мы проиллюстрировали его применимость в качестве теста POC для клинических образцов без предварительной экстракции нуклеиновых кислот (с использованием Y.pestis с добавлением образцов мокроты). Наконец, мы также демонстрируем практическую применимость PCA в контексте биотерроризма с использованием тяжелых средств индивидуальной защиты, демонстрируя, таким образом, широкий спектр возможных применений PCA, актуальных для диагностики забытых тропических болезней, таких как легочная чума.

Материалы и методы

Усиление с импульсным управлением

Подобно ПЦР, амплификация с импульсным управлением (PCA) основана на экспоненциальной амплификации конкретного целевого фрагмента нуклеиновой кислоты для последующего обнаружения.Амплификация достигается за счет связывания специфичных для мишени комплементарных олигонуклеотидных праймеров с матричной ДНК с последующим удлинением праймера ферментом ДНК-полимеразой. PCA также основывается на термоциклировании, однако вместо трудоемкого чередования нагрева и охлаждения всего реакционного объема («общий нагрев») быстрые субмиллисекундные импульсы напряжения прикладываются к массиву из 75 покрытых золотом вольфрамовых проволок (15 диаметр мкм, покрытие из золота 200 нм), вызывая сверхбыстрый нагрев в пределах слоя жидкости размером всего в один микрометр, окружающего каждую проволоку («локальный нагрев»).Оставшаяся часть реакционного объема (более 99%) поддерживается при базовой температуре, используемой для отжига и удлинения. Подход «локального нагрева» денатурирует двунитевую (ds) ДНК только в нагретом слое, окружающем провода, что делает необходимым также локализацию части реакции. Это достигается путем прикрепления одного из грунтовок к проводящим металлическим структурам микромасштабов (в данном исследовании вольфрамовые проволоки с золотым покрытием). Другой праймер остается свободным в растворе, обеспечивая кинетические преимущества свободной реакции.В результате стадия денатурации дцДНК реакции амплификации требует только части энергии, обычно необходимой для термоциклирования всего реакционного объема. Локальный нагрев позволяет проводам остыть после импульса напряжения, который запускает этап денатурации за счет тепловой диффузии в миллисекундном масштабе времени. Большая часть реакционного объема служит охлаждающим резервуаром для полностью пассивного процесса охлаждения встроенных проводов, что приводит к сверхбыстрым тепловым циклам. Это сокращает общее время процесса усиления до десяти раз по сравнению с ПЦР, поскольку сотни импульсов энергии могут иметь место за короткий промежуток времени.Как и кПЦР, амплификацию можно проследить в реальном времени с помощью интеркалирующих красителей или, как в нашем исследовании, зондов гидролиза (рис. 1).

Рис. 1.

Схема процесса PCA и взаимодействия праймеров и покрытых золотом проводов (A) (уменьшено) Тиоловая модификация была добавлена ​​к 5′-концу праймера с использованием поли-A-хвоста и Int Spacer 9, обеспечивая прочную связь AU-S и иммобилизацию праймера на покрытых золотом проволоках (B) Отжиг, гибридизация зонда и удлинение (C) PCA использует термоциклирование, но вместо трудоемкого чередования нагрева и охлаждения всего В реакционной смеси к золотым проводам прикладываются быстрые импульсы энергии, вызывающие сверхбыстрый локальный нагрев и денатурацию дцДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.g001

В настоящее время PCA выполняется на прототипе прибора Pharos Micro (GNA Biosolutions, Martinsried, Германия) с использованием прототипных одноразовых чипов, которые содержат реакции амплификации. (GNA Biosolutions, Мартинсрид, Германия). Для оптимизации анализов можно регулировать различные параметры цикла, включая температуру основания и крышки Pharos Micro [° C], время нагрева [мкс], время цикла [с], количество циклов и время термализации [с].При проектировании грунтовки следует руководствоваться указаниями, приведенными в Таблице 1. Для успешного проведения PCA критически важно избегать димеров праймеров при разработке праймеров, особенно для тиолированного праймера, используемого для функционализации проводов.

Микропрототип Pharos и конструкция микросхемы

Прототип Pharos Micro (GNA Biosolutions, Мартинсрид, Германия), использованный в этом исследовании, состоит из напечатанного на 3D-принтере корпуса и крышки размером 100 x 175 x 110 мм (Ш x Г x В) и весит 900 г (рис. 2). Прибор оснащен светодиодами и фильтрами для обнаружения флуоресценции в реальном времени и электронными модулями управления.Два обычных нагревательных блока устанавливают на постоянную температуру в нижней и верхней части чипа, чтобы поддерживать реакционный объем на постоянной температуре 65 ° C для отжига и удлинения. Прототип Pharos Micro питается от батареи для использования в полевых условиях (с использованием имеющегося в продаже блока питания) или может быть подключен к источнику питания (230 В) в стационарной лаборатории. Он управляется специальным программным обеспечением (GNA Biosolutions, Martinsried, Германия) на планшете (или ноутбуке), подключенном к прибору через USB.Одноразовые тестовые чипы-прототипы состоят из поли (метилметакрилата) (ПММА) и имеют восемь лунок, каждая из которых соответствует реакционному объему 40–80 мкл (рис. 2). Все лунки оснащены 75 параллельными вольфрамовыми микропроволками с золотым покрытием диаметром 15 мкм, что обеспечивает сопротивление ≈500 мОм. Провода обеспечивают электрический контакт с прототипом Pharos Micro на обоих концах. Праймеры присоединяются к проводам на этапе функционализации. После загрузки образца чипы заклеиваются липкой лентой.Более подробную информацию о прототипе можно найти во вспомогательной информации (S1 Text).

Рис. 2. Прототип Pharos Micro.

Верхняя панель: текущая модель 8-луночного дуплексного ручного прототипа системы «образец-ответ» для исследований и разработки анализов с использованием подхода PCA. Средняя панель: схематический вид (справа), показывающий концепцию прибора: одноразовый чип (желтый) зажат между двумя нагревательными блоками (серый), которые используются для установки базовой температуры. Измерения трансмиссионной флуоресценции (многоцветные светодиоды вверху, фотодиоды внизу) для химического состава гидролизного зонда, а также схема цепи для управления PCA, которая в основном требует только конденсатора и быстрого переключателя (т.е.е. полевой МОП-транзистор) для подачи импульсов, необходимых для локального нагрева. Нижняя панель: прототип микросхемы. Каждый PMMA-чип имеет восемь лунок с 75 ультратонкими покрытыми золотом вольфрамовыми микросхемами, проходящими через весь чип на дне каждой лунки.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.g002

Функционализация микросхем

Чипы

функционализировали прямым праймером (модифицированным тиолом). Праймер разбавляли в буфере для функционализации 2 (GNA Biosolutions, Martinsried, Германия) до конечной концентрации 500 нМ.50 мкл разбавленного праймера загружали в каждую лунку и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Функционализирующий раствор удаляли, а лунки пять раз промывали деминерализованной водой. После промывки стружку удаляли, а сухую стружку хранили при 4 ° C до дальнейшего использования. Чипсы готовили свежими каждое утро, однако их можно хранить до пяти дней без значительной потери эффективности. Чипы предназначены только для одноразового использования.

Анализ Yersinia pestis pla PCA

Ю.Праймеры и зонды, специфичные для гена pla pestis, были разработаны на основе исследований сопоставления с использованием BLAST и базы данных последовательностей Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Пара праймеров и зонд, показавшие наилучшие результаты в пилотных экспериментах, были использованы для экспериментов PCA (таблица 2). Праймеры и зонд были получены от Ella Biotech (Martinsried, Германия). Прямой праймер был модифицирован, как показано в таблице 2, включая тиоловую модификацию, часть поли-А и внутренний спейсер. Все реакции проводили с использованием лиофилизированной мастер-смеси (GNA Biosolutions, Martinsried, Германия), содержащей все необходимые компоненты.Оптимальные концентрации для всех компонентов были определены в пилотных экспериментах, и конечные концентрации показаны в таблице 3. Для PCA мастер-смесь растворяли в соответствующем количестве воды, свободной от ДНКазы, до достижения конечного реакционного объема 40 мкл.

Для прогона PCA использовались следующие параметры: термализация 10 с, 550 циклов, время цикла 1,5 с, температура крышки 73 ° C, базовая температура 66 ° C, нагрев 350 мкс.

Для образцов, содержащих очищенную геномную ДНК в качестве матрицы, лиофилизированную маточную смесь растворяли в 316.8 мкл воды, свободной от ДНКазы. В каждую лунку чипа загружали 36 мкл мастермикса и добавляли 4 мкл матрицы. При использовании бактериального культурального материала и мокроты с добавками в качестве образцов начальный термический лизис и связывание целевой ДНК с праймерами, прикрепленными к проводам, выполняли до PCA: загружали 60 мкл / лунку жидкого культурального материала. Чипы закрывали и помещали в Pharos Micro на 5 мин (при базовой температуре 66 ° C). После инкубации культуральный материал удаляли и отбрасывали, лиофилизированную маточную смесь растворяли в 352 мкл воды, свободной от ДНКазы, и 40 мкл добавляли непосредственно в каждую лунку.

Определение точности и предела обнаружения

Количество копий

плазмы серийных разведений очищенной ДНК, а также материала мокроты с добавлением неочищенной культуры определяли с помощью ddPCR. Затем были исследованы чувствительность и воспроизводимость PCA для всех трех типов образцов, и 95% предел обнаружения (LOD) был определен с помощью стандартного пробит-регрессионного анализа (S1 Fig) с использованием программного обеспечения STATGRAPHICS Centurion 18 (версия 18.1.12) и после Рекомендации MIQE [16].Каждый PCA выполнялся трижды с шестью повторами для каждого тестируемого разведения и типа образца.

Анализ бокового потока

Мы использовали анализ бокового потока miPROTECT Plague (Miprolab, Göttingen, Германия) в качестве стандартного эталонного метода для обнаружения Y. pestis в жидкой культуре в полевых условиях. Тесты проводились в соответствии с протоколом, предоставленным производителем, и результаты были получены через 20 минут.

Бактериальная культура

Ю.pestis штамм EV76 был использован в качестве модельного организма в этом исследовании. Жидкие культуры выращивали в LB – бульоне при 37 ° C. Для сопоставимости экспериментов культуры Y. pestis разводили до стандарта МакФарланда 0,5 с последующими серийными 10-кратными разведениями в среде LB, которые затем использовали для экспериментов. Свежие разведения готовили каждый день.

Для экспериментов с инактивированным образцом в полевых условиях фиксацию культурального материала проводили 4% параформальдегидом (PFA). Для этого 1 мл жидкой культуры центрифугировали при 14000 об / мин в течение 2 минут.Супернатант удаляли, осадок клеток ресуспендировали в 1 мл PBS и снова центрифугировали. Супернатант отбрасывали, осадок клеток ресуспендировали в 250 мкл PBS и 750 мкл 4% PFA и фиксировали при 4 ° C в течение ночи. Чтобы удалить PFA из фиксированного образца, его центрифугировали при 14000 об / мин в течение 2 минут, супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в 1 мл PBS и хранили при 4 ° C до дальнейшего использования. Чтобы смоделировать зараженную культуру в подпольной лаборатории и подвергнуть тест высокому нецелевому фону, клетки-мишени смешивали в соотношении 1: 100 с Escherichia coli.

Для экспериментов с моделированным материалом пациента в образцы мокроты (анонимные диагностические остатки) добавляли ночные культуры штамма Y. pestis EV76. Культуры разбавляли до стандарта McFarland Standard 0,5 (1 мл), центрифугировали (14000 об / мин, 2 минуты) и осадки ресуспендировали в мокроте (1 мл) с последующими 10-кратными разбавлениями в мокроте.

Препарат ДНК

Для экстракции ДНК использовали 1 мл жидкой культуры Y. pestis с McFarland 0,5. Очищенную ДНК получали с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.ДНК элюировали 50 мкл буфера для элюции и хранили при -20 ° C до дальнейшего использования. Концентрацию ДНК определяли с помощью количественного анализа высокой чувствительности (HS) Qubit dsDNA в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили с помощью флуорометра Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, USA).

Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)

КПЦР использовали в качестве эталонного метода для амплификации ДНК Y. pestis. КПЦР выполняли, как описано ранее Riehm et.al. с использованием целевой области pla [17]. В этом исследовании объем образца составлял 5 мкл, и анализ проводили с использованием Rotor-Gene Q 2plex (Qiagen, Hilden, Германия).

Секвенирование MinIon 16S

Для 16S-секвенирования очищенного образца ДНК библиотеку готовили с использованием набора Oxford Nanopore16S Barcoding Kit (SQK-RAB204) в соответствии с протоколом производителя (Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания). Секвенирование выполняли на MinIon с использованием проточной кюветы, а определение оснований выполняли с использованием MinIT (Oxford Nanopore Technologies, Оксфорд, Великобритания).

Цифровая капельная ПЦР

ddPCR использовали для точного количественного определения количества копий (pla) и клеток-мишеней в образцах, использованных в этом исследовании. Поскольку наш анализ PCA использует ген pla на многокопийной плазмиде pPCP1 в качестве целевой последовательности для обнаружения Y. pestis, цифровая капельная ПЦР (ddPCR) использовалась для точного определения количества копий плазмиды pPCP1 в штамме EV76, используемом в этом исследовании. : Число копий генома Y. pestis определяли с использованием ddPCR на основе EvaGreen. Напротив, для количественного определения плазмиды pPCP1 выполняли pla-специфический ddPCA и сравнивали числа копий для определения количества плазмид на бактериальную клетку.Все количественные определения были выполнены в трех повторностях и в трех биологических повторностях.

Праймеры и зонды использовали, как описано Riehm et. др. [17] для pla-специфической ддПЦР и были получены от TIB MOLBIOL (Берлин, Германия). 20 мкл реакционной смеси ddPCR на образец содержали 10 мкл 2X Supermix for Probes (без dUTP), 1,8 мкл каждого праймера (10 мкМ мкл -1 ), 0,5 мкл зонда (10 мкМ мкл -1 ) и 2 мкл шаблон. EvaGreen ddPCR выполняли, как описано ранее Ziegler et.al. [11].

капель генерировали с использованием генератора капель BioRad QX100 Hercules, США), а ПЦР выполняли на 96-луночном термоциклере Veriti (Applied Biosystems, Foster City, США) в следующих условиях реакции:

pla: 10 минут при 95 ° C, затем 40 циклов по 30 секунд при 95 ° C и 1 минута при 60 ° C и крутизна 2 ° C с -1 . Для дезактивации фермента в конце выполняли последний этап нагревания в течение 10 минут при 98 ° C.

EvaGreen: 5 мин при 95 ° C, 40 циклов по 30 с при 95 ° C и 1 мин при 60 ° C и крутизна 2 ° C с -1 .Для стабилизации сигнала и инактивации ферментов в конце выполняли заключительную стадию охлаждения и нагревания: 5 минут при 4 ° C и 5 минут при 90 ° C.

ДдПЦР

оценивали с помощью устройства для считывания капель BioRad QX100 (Hercules, США) и соответствующего программного обеспечения QuantaSoft Analysis Pro.

Результаты

Число копий плазмиды pPCP1

Для штамма Y. pestis EV76, использованного в этом исследовании, количество копий плазмиды pPCP1 на клетку-мишень определяли с помощью ddPCR. Количественная оценка клеток-мишеней с помощью ddPCR EvaGreen показала 6.5 x 10 7 клеток на мл (McFarland 0,5). pla-специфическая ddPCR тех же образцов выявила в среднем 3,4 × 10 9 плазмид pPCP1 на мл, что привело к в среднем 52,3 плазмид pPCP1 на клетку-мишень.

Обнаружение Y. pestis в стандартных лабораторных условиях

Мы применили РСА к Y. pestis, используя ген pla в качестве мишени и очищенную геномную ДНК в качестве матрицы. Хотя отрицательный контроль не давал сигнала, амплификация наблюдалась во всех образцах, содержащих матрицу (в дубликатах).Порог обнаружения был достигнут за 03:54 минуты (10e8 копий) и 6:50 минут (10e5 копий), а весь цикл PCA был завершен за 13,75 минут. Однако начало амплификации явно не зависело линейно от логарифма начального числа копий, что указывает на то, что PCA в его текущей реализации является качественным или только полуколичественным методом (рис. 3A).

Рис. 3. Обнаружение гена Pla Y. pestis.

(A) Различные концентрации ДНК были протестированы в дублирующих реакциях с использованием очищенной ДНК в качестве матрицы.Экспоненциальная амплификация наблюдалась для положительного контроля, содержащего 10 8 копий (зеленый), и всех образцов, содержащих шаблон: 10 7 (красный), 10 6 (оранжевый), 10 5 (синий) копий на реакцию. . Для отрицательного контроля (черный) амплификации не наблюдалось. Начало амплификации явно не зависело от логарифма числа использованных копий, что указывает на полуколичественное качество PCA (B) Y. pestis-специфического PCA было выполнено с сырым материалом образца и начальной стадией 5-минутной гибридизации перед PCA.Экспоненциальная амплификация наблюдалась для положительного контроля (зеленый), неразбавленного образца (3,9 × 10 6 клеток на реакцию; красный), разведения 1:10 (желтый) и разведения 1: 100 (синий) образца. Не наблюдали амплификации для образца, не содержащего бактериального культурального материала (черный) (C). PCA выполняли в двух повторностях с различными разведениями Y. pestis в образцах мокроты (неочищенный материал образца). Амплификацию наблюдали для всех разведений (1:10 синий, 1: 100 красный) образцов мокроты с добавками (красный и желтый) до 8 × 10 2 клеток на мл (≈48 клеток на реакцию).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.g003

Для оценки области применения PCA и POC, то есть тестирования образцов без предварительной экстракции нуклеиновых кислот, мы применили тот же протокол PCA к 10-кратным серийным разведениям неочищенные образцы (культуральный материал, выделенная мокрота) Y. pestis, но добавлен дополнительный 5-минутный этап инкубации при базовой температуре 66 ° C. При подготовке полевых испытаний, во время которых можно было использовать только инактивированный образец, начальные эксперименты были выполнены с PFA-фиксированным культуральным материалом, и наблюдалась чистая амплификация для всех испытанных логарифмических разведений образца, в то время как отрицательные контроли не давали никакого сигнала.Впоследствии все эксперименты были повторены с 10-кратными серийными разведениями нефиксированного культурального материала и образцов мокроты с добавлением Y. pestis по тому же протоколу. Опять же, амплификацию можно было наблюдать для всех клеток-мишеней, содержащих образцы, тогда как для отрицательных контролей амплификации не наблюдалось (рис. 3B и 3C).

Аналитическая точность и предел обнаружения

Результаты пробит-регрессионного анализа показали, что LOD (95%) составляет 434 копий на реакцию для очищенной ДНК и 35 клеток на реакцию (≈583 клеток / мл) для сырого культурального материала и указывает на эффективную воспроизводимость анализа.Обнаружение меньшего числа копий было возможным, но менее воспроизводимым для анализа pla PCA.

Оценка специфичности

Чтобы определить специфичность анализа pla, PCA выполняли в дубликатах с очищенной ДНК различных бактерий, перечисленных в таблице S1. На основании полногеномных последовательностей Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis классифицируются как ближайшие филогенетические соседи [18]. Для этих близкородственных видов специфичность была проверена в трех экземплярах не только с очищенной ДНК, но и с бактериальным культуральным материалом.Для всех протестированных бактерий PCA был отрицательным, что подтверждает специфичность анализа.

Оценка обработки полей

Для оценки осуществимости метода в полевых условиях (т.е. тестирование непосредственно на месте отбора проб, питание от батареи, без предварительной экстракции нуклеиновых кислот, операторы носят СИЗ), PCA и LFA были выполнены параллельно в учебном сценарии во время международного CBRN-live. агентские учения Precise Response 2019 в Саффилде, Канада. По этому сценарию подпольная лаборатория была обыскана спецназом в полностью закрытых СИЗ.Мутный жидкий бульон, инкубированный при 28 ° C, и данные из научной литературы указывают на попытку вырастить Y. pestis. После отбора проб жидкой бактериальной культуры оба теста были выполнены одновременно. Результаты были получены через 20 минут. В то время как LFA не смог обнаружить Y. pestis (рис. 4B) — это указывает на то, что в анализируемом образце содержится менее 10 4 клеток-мишеней на мл [11], — PCA был положительным в трех из пяти повторов, в то время как оба отрицательные. контроли не производили сигнал (рис. 4A).Затем образец был проанализирован в нашей стационарной лаборатории. После экстракции ДНК проводили кПЦР и 16S-секвенирование и подтвердили присутствие Y. pestis в материале полученного образца вместе с большими количествами Escherichia coli (S2, фиг.).

Рис. 4. PCA можно проводить в полевых условиях.

PCA и LFA, специфичные для Y. pestis, проводили параллельно в полевых условиях с использованием тяжелых средств индивидуальной защиты (СИЗ). Результаты обоих тестов были получены в течение 20 минут.(A) PCA: отрицательные контроли (черный), образец (красный) (B) LFA: тест был действителен, как указано контрольной линией, но был отрицательным для Y. pestis.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.g004

Обсуждение

PCA — это новый метод, основанный на принципе ПЦР, который может эффективно использоваться как RDT при обнаружении инфекционных агентов в средах с ограниченными ресурсами. Для прямого сравнения PCA и LFA был разработан тест на обнаружение Y. pestis.Поскольку PCA основан на амплификации и обнаружении нуклеиновых кислот, в качестве мишени использовали ген pla Y. pestis. Из-за высокого числа копий среди биовара Orientalis (52 копии для штамма EV76, использованного в этом исследовании), pla является часто используемой мишенью [17,19]. Однако важно учитывать, что, поскольку плазмаферез может быть обнаружен в других энтеробактериях, таких как Citrobacter koseri и Escherichia coli [20], следует применять подтверждающую ПЦР с дополнительными мишенями (например, caf1 [21]). Кроме того, для PCA следует разработать новые специфические тесты, нацеленные на мишени с множеством копий, такие как 16S или 23S рибосомная РНК.

Результаты этого исследования показывают, что PCA можно применять как к очищенному, так и к неочищенному образцу. Быстрый и легкий рабочий процесс (примерно 20 минут от начала до конца) сопоставим со временем, необходимым для большинства LFA. Кроме того, мы продемонстрировали применимость этого быстрого рабочего процесса для неочищенного материала образца, включая образцы мокроты — очень актуальную матрицу клинических образцов для диагностики легочной чумы [4]. Для полевых испытаний мы дополнительно проверили прототип устройства, смешав целевые бактерии с нецелевыми бактериями в соотношении 1: 100 (E.coli), имитируя зараженную культуру в подпольной лаборатории. PCA был способен обнаруживать целевой организм даже в этом массивном нецелевом фоне. Несмотря на то, что мы использовали устройство в полевых условиях в сложных условиях и на пределе обнаружения (<10 4 клеток-мишеней на мл, смешанных 1: 100 с нецелевыми клетками), тот факт, что 3 из 5 повторов были положительными, в то время как одновременно проведенная LFA была отрицательной, иллюстрирует преимущества этой технологии перед LFA и ее потенциал для применения в полевых условиях.В текущих условиях — особенно с pla в качестве единственной мишени для обнаружения Y. pestis — такой результат, конечно, потребует подтверждения, например, с помощью ПЦР в реальном времени или путем реализации мультиплексного анализа с дополнительными мишенями. Однако полевые результаты всегда рассматриваются как предполагаемые и в обязательном порядке требуют подтверждения.

LOD (95%) очищенной ДНК составляла 434 копий на реакцию, однако, поскольку LFA являются тестами на основе антигенов, результаты нельзя сравнивать напрямую. В качестве косвенного сравнения мы определили, что PCA более чувствителен при обнаружении Y.pestis в культуральном материале с LOD (95%) 583 клеток / мл, что является результатом эффекта высокой дозы гена. Этот LOD намного ниже описанного LOD для Y. pestis LFA — как показано на отрицательном LFA, который мы одновременно провели в полевых условиях. С другой стороны, если сравнивать с pla-специфической кПЦР, становится ясно, что кПЦР более чувствительна с опубликованными LOD (95%), составляющими всего 0,1 эквивалента генома [22]. Однако, что касается ПЦР, чувствительность PCA зависит от анализа. В другом недавно опубликованном исследовании был разработан анализ PCA для обнаружения SARS-CoV-2, иллюстрирующий возможность разработки анализа PCA с обратной транскриптазой для обнаружения РНК-вирусов [23].При сравнении времени с результатом PCA намного быстрее дает результаты (общее время выполнения 13,75 мин), чем ПЦР в реальном времени (> 60 минут). Как показано в полевых упражнениях, время от взятия пробы до получения результата составляет всего 20 минут и, таким образом, соответствует времени, необходимому для одновременно проводимой LFA. По сравнению с ПЦР в реальном времени результаты являются лишь полуколичественными, но все же предоставляют больше количественной информации, чем LFA. Взятые вместе, приведенные выше результаты демонстрируют, что как технология молекулярной диагностики PCA сочетает в себе некоторые из наиболее полезных элементов как LFA, так и PCR: (I) он более чувствителен и специфичен, чем LFA (II), он так же специфичен, как PCR, ( III) требуется часть времени, необходимого для ПЦР и (IV), в отличие от ПЦР, он может быть выполнен на доступной, с питанием от батареи, легкой и, следовательно, портативной платформе, которая позволяет проводить испытания в внелабораторных или нетрадиционных лабораторных условиях, например а также Point of Care.Как описано ранее [6] сублимационная сушка химии ПЦР является важным фактором стабильности и использования в полевых условиях. Соответственно, все критические компоненты анализа чумы, использованные в этом исследовании, были высушены вымораживанием.

Благодаря своей скорости и портативности, PCA облегчает чувствительное обнаружение инфекционных агентов на основе нуклеиновых кислот в внелабораторной среде POC. В 2003 г. ВОЗ определила семь идеальных характеристик тестов, которым должны соответствовать все недавно разработанные средства диагностики POC. Основываясь на аббревиатуре «ОБЕСПЕЧЕНО», эти тесты должны быть доступными, чувствительными, конкретными, удобными для пользователя, быстрыми и надежными, без оборудования и с доставкой [24].Однако даже в 2020 году практически не существует тестов, отвечающих этим критериям. Хотя LFA соответствуют некоторым критериям, изложенным ВОЗ, им очень не хватает чувствительности и специфичности, как описано ранее. С другой стороны, ПЦР не является быстрым и не требует использования оборудования. Кроме того, для выполнения и оценки требуются дорогостоящие приборы и обученный медицинский персонал. Более того, высокое энергопотребление преобладает при работе от батареи всех устройств ПЦР в реальном времени, тогда как платформа PCA требует только 8 Вт на цикл и, таким образом, может питаться от солнечных батарей.Платформа PCA будет стоить менее 15 TSD € и, следовательно, будет дешевле, чем FilmArray или большинство машин ПЦР в реальном времени. Одна реакция стоит примерно 7 евро и, таким образом, значительно дешевле, чем один анализ бокового потока, который обычно стоит от 35 до 49 евро за тест. PCA является быстрым, чувствительным, специфичным, требует минимального оборудования и относительно прост в исполнении. Например, полевой протокол основан на одноразовых пипетках Пастера и требует лишь минимального количества этапов дозирования. Однако PCA требует первоначального обучения для выполнения и оценки анализа.

Из-за простоты дизайна анализа PCA, который требует того же количества праймеров, что и обычная ПЦР, может оказаться возможным перевести большинство существующих анализов PCR в реальном времени в формат PCA с небольшими модификациями / оптимизацией или без них. Более того, в обычной ПЦР методы экстракции нуклеиновых кислот часто необходимы перед амплификацией и детектированием, тем самым продлевая всю процедуру и ограничивая ее применимость в полевых условиях. Технология PCA также подходит для мультиплексного формата (в настоящее время два канала: FAM и Cy5).В то время как другие коммерчески доступные платформы, такие как FilmArray [25], позволяют проводить высокоэффективный мультиплексный скрининг на несколько патогенов, их требования к питанию делают их привязанными к лаборатории, поэтому они не являются настоящими технологиями в месте оказания медицинской помощи или в месте обнаружения. Кроме того, высокая стоимость инструментов и анализов также препятствует широкому использованию таких устройств, особенно в странах третьего мира. Поскольку PCA, в отличие от многих «закрытых» картриджных систем, таких как FilmArray или GeneXpert, является системой с открытым исходным кодом, существующие внутрифирменные анализы ПЦР в реальном времени можно легко перенести в PCA для диагностики.Конечно, не все матрицы образцов одинаково подходят для прямого PCA без предварительной экстракции нуклеиновых кислот. Цельная кровь, например, так же как и необработанные образцы почвы, не работали при прямом PCA. Однако существуют доступные протоколы быстрой экстракции нуклеиновых кислот без использования инструментов, которые предположительно облегчают анализ POC таких сложных матриц [26].

В заключение, мы продемонстрировали новый сверхбыстрый метод амплификации и обнаружения нуклеиновой кислоты с помощью импульсной управляемой амплификации (PCA).PCA сочетает в себе скорость LFA или изотермических методов с простотой анализа ПЦР в новой портативной системе с батарейным питанием. Эта работа успешно демонстрирует примеры применения PCA для обнаружения Y. pestis в лабораторных, медицинских и полевых условиях. Он расширяет использование молекулярного тестирования до внелабораторных или нетрадиционных лабораторных условий, а также в условиях, близких к пациенту, и имеет потенциал стать мощной технологией в обнаружении нуклеиновых кислот для передовых и полевых приложений.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Аналитический предел обнаружения.

(A) Регрессионный анализ пробита (слева) показывает LOD (95%) 434 копий на реакцию для очищенной ДНК. Результаты PCA (справа) образцов, содержащих 1 × 10 4 (красный) копий на реакцию и 413 (желтых) копий на реакцию (отрицательный контроль, черный). (B) Пробит-регрессионный анализ (слева) показывает LOD (95%) 1824 копий на реакцию. Учитывая, что штамм EV76, использованный в этом исследовании, содержал 52 копии pPCP1, это равнялось 35 клеткам на реакцию.Результаты PCA (справа) неочищенного культурального материала, содержащего 3,9 × 10 4 (зеленый) копий на реакцию (≈750 клеток) и 1800 (желтый) копий на реакцию (≈34,6 клеток).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.s002

(TIF)

S2 Рис.

Обычная кПЦР и 16S-секвенирование подтверждают, что Y. pestis в полевом образце (A) Образец ДНК был извлечен и подвергнут стандартной пла-специфической КПЦР в нашей стационарной лаборатории. Присутствие Y. pestis соответствовало (образец: желтый, положительный контроль: красный, отрицательный контроль: синий) (B) График кроны: последующее секвенирование образца 16S выявило большое количество контаминирующих бактерий (> 95% Enterobacteriacea) и лишь небольшое количество (0.5%) Y. pestis.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.s003

(TIF)

S1 Таблица. Не наблюдалось перекрестной реактивности ни с одной из протестированных бактерий, что подтверждает специфичность анализа pla (АТСС: Американская коллекция типовых культур; Немецкая коллекция микроорганизмов и культур DSMZ; NCTC: Национальная коллекция типовых культур).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009114.s004

(XLSX)

Ссылки

  1. 1.10 основных причин смерти. [цитировано 24 апреля 2020 г.]. Доступно: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death
  2. 2.
    CDC | Агенты / болезни биотерроризма (по категориям) | Готовность к чрезвычайным ситуациям и реагирование. 15 мая 2019 г. [цитировано 31 марта 2020 г.]. Доступно: https://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp
  3. 3.
    Рандреманана Р., Андрианаивоариманана В., Николай Б., Рамасиндразана Б., Пайро Дж., Bosch QA ten и др. Эпидемиологические характеристики городской эпидемии чумы на Мадагаскаре, август – ноябрь 2017 г .: отчет о вспышке.Ланцетные инфекционные болезни. 2019; 19: 537–545. pmid: 30930106
  4. 4.
    Rajerison M, Melocco M, Andrianaivoarimanana V, Rahajandraibe S, Rakotoarimanana F, Spiegel A, et al. Сравнение результатов экспресс-диагностики чумы с бактериологией: ретроспективный анализ данных, собранных на Мадагаскаре. BMC Инфекционные болезни. 2020; 20: 90. pmid: 32000692
  5. 5.
    Валлес X, Стенсет NC, Демер С., Хорби П., Мид П.С., Кабанильяс О. и др. Человеческая чума: старая беда, требующая новых ответов.PLoS Negl Trop Dis. 2020; 14: e0008251. pmid: 32853251
  6. 6.
    Цюй С., Ши Кью, Чжоу Л., Го З., Чжоу Д., Чжай Дж. И др. Стабильные количественные ПЦР-реагенты в окружающей среде для обнаружения Yersinia pestis. PLOS «Забытые тропические болезни». 2010; 4: e629. pmid: 20231881
  7. 7.
    Вентилятор Дж., Крафт А.Дж., Хенриксон К.Дж. Современные методы быстрой диагностики инфекционных агентов, связанных с биотерроризмом. Pediatr Clin North Am. 2006; 53: 817–842, vii – viii. pmid: 17027612
  8. 8.Постхума-Трампи Т., Ван Амеронген А. Анализ бокового потока (иммуно): его сильные и слабые стороны, возможности и угрозы. Обзор литературы. Аналитическая и биоаналитическая химия. 2008; 393: 569–82. pmid: 18696055
  9. 9.
    Peeling RW, Mabey D. Тесты для диагностики инфекций в развивающихся странах. Clin Microbiol Infect. 2010; 16: 1062–1069. pmid: 20670288
  10. 10.
    Засада А.А., Форминска К., Захарчук К., Якоб Д., Грунов Р. Сравнение одиннадцати коммерчески доступных экспресс-тестов для обнаружения Bacillus anthracis, Francisella tularensis и Yersinia pestis.Письма по прикладной микробиологии. 2015; 60: 409–413. pmid: 25598285
  11. 11.
    Зиглер И., Фоллмар П., Кнюпфер М., Браун П., Стокер К. Переоценка пределов обнаружения 12 иммуноанализов бокового потока для обнаружения спор Yersinia pestis, Francisella tularensis и Bacillus anthracis с использованием жизнеспособных штаммов группы риска-3. Журнал прикладной микробиологии. нет данных pmid: 32970936
  12. 12.
    Прентис К.В., ДеПальма Л., Рэймидж Дж. Г., Сарвар Дж., Парамесваран Н., Петерсен Дж. И др.Комплексная лабораторная оценка анализа бокового потока для обнаружения Yersinia pestis. Health Secur. 2019; 17: 439–453. pmid: 31859568
  13. 13.
    Кайперс Дж., Джером К.Р. Применение цифровой ПЦР в клинической микробиологии. Журнал клинической микробиологии. 2017; 55: 1621–1628. pmid: 28298452
  14. 14.
    Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. Обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО) с использованием изотермической амплификации последовательностей ДНК-мишени. BMC Biotechnol.2009; 9: 7. pmid: 19187544
  15. 15.
    Watts MR, James G, Sultana Y, Ginn AN, Outhred AC, Kong F и др. Петлевой изотермической амплификации (LAMP) анализ Strongyloides stercoralis в стуле, который использует метод визуального обнаружения с флуоресцентным красителем SYTO-82. Am J Trop Med Hyg. 2014; 90: 306–311. pmid: 24323513
  16. 16.
    Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж. А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж., Кубиста М. и др. Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени.Clin Chem. 2009; 55: 611–622. pmid: 19246619
  17. 17.
    Рим Дж. М., Рахалисон Л., Шольц Х. С., Тома Б., Пфеффер М., Разанакото Л. М. и др. Обнаружение Yersinia pestis с помощью ПЦР в реальном времени у пациентов с подозрением на бубонную чуму. Молекулярные и клеточные зонды. 2011; 25: 8–12. pmid: 20933595
  18. 18.
    Рейтер С., Коннор Т.Р., Барквист Л., Уокер Д., Фелтуэлл Т., Харрис С.Р. и др. Параллельная независимая эволюция патогенности внутри рода Yersinia. PNAS. 2014; 111: 6768–6773.pmid: 24753568
  19. 19.
    Parkhill J, Wren BW, Thomson NR, Titball RW, Holden MT, Prentice MB и др. Последовательность генома Yersinia pestis, возбудителя чумы. Природа. 2001; 413: 523–527. pmid: 11586360
  20. 20.
    S H, E C, G C, G G, R B, NC S и др. Ген pla, кодирующий активатор плазминогена, не специфичен для Yersinia pestis. BMC Res Notes. 2015; 8: 535–535. pmid: 26438258
  21. 21.
    Engelthaler DM, Gage KL, Montenieri JA, Chu M, Carter LG.ПЦР-обнаружение Yersinia pestis у блох: сравнение с инокуляцией мышей. J Clin Microbiol. 1999; 37: 1980–1984. pmid: 10325359
  22. 22.
    Tomaso H, Reisinger EC, Al Dahouk S, Frangoulidis D, Rakin A, Landt O и др. Быстрое обнаружение Yersinia pestis с помощью множественных ПЦР-анализов в реальном времени с использованием флуоресцентных гибридизационных зондов. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003. 38: 117–126. pmid: 13129646
  23. 23.
    Zwirglmaier K, Weyh M, Krueger C, Ehmann R, Mueller K, Woelfel R, et al.Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 с помощью импульсного усиления (PCA). medRxiv. 2020; 2020.07.29.20154104.
  24. 24.
    Kettler H, White K, Hawkes SJ, Diseases UBSP for R and T in T. Составление карты диагностики инфекций, передаваемых половым путем: основные выводы и рекомендации. 2004 [цитировано 13 февраля 2020 года]. Доступно: https://apps.who.int/iris/handle/10665/68990
  25. 25.
    Пориц М.А., Блашке А.Дж., Байингтон С.Л., Мейерс Л., Нильссон К., Джонс Д.Э. и др. FilmArray, автоматизированная система вложенной мультиплексной ПЦР для обнаружения множественных патогенов: разработка и применение при инфекциях дыхательных путей.PLoS One. 2011; 6. pmid: 22039434
  26. 26.
    Zou Y, Mason MG, Wang Y, Wee E, Turni C, Blackall PJ и др. Очистка нуклеиновых кислот от растений, животных и микробов менее чем за 30 секунд.